Préparation des granules de Gushukang (GSK) pour les expériences in vivo et in vitro
Summary
Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation d’une solution de travail de granules de Gushukang pour les études animales et de granule GSK contenant du sérum pour les expériences in vitro. Ce protocole peut être appliqué aux études pharmacologiques des plantes médicinales ainsi qu’aux prescriptions d’expériences in vivo et in vitro.
Abstract
La phytothérapie traditionnelle chinoise joue un rôle comme méthode alternative dans le traitement de nombreuses maladies, telles que l’ostéoporose postménopausique (POP). Les granules de Gushukang (GSK), une prescription commercialisée en Chine, ont des effets protecteurs osseux dans le traitement du POP. Avant l’administration au corps, une procédure standard de préparation est généralement nécessaire, qui vise à promouvoir la libération des constituants actifs à partir d’herbes premières et d’améliorer les effets pharmacologiques ainsi que les résultats thérapeutiques. Cette étude propose un protocole détaillé pour l’utilisation des granules GSK in vivo et in vitro essais expérimentaux. Les auteurs fournissent d’abord un protocole détaillé pour calculer les doses appropriées pour l’animal des granules pour l’enquête in vivo : pesée, dissolution, stockage, et administration. Deuxièmement, cet article décrit des protocoles pour le balayage de micro-CT et la mesure des paramètres d’os. La préparation des échantillons, les protocoles d’exécution de la machine à micro-CT et la quantification des paramètres osseux ont été évalués. Troisièmement, des granules GSK contenant du sérum sont préparés, et le sérum contenant des médicaments est extrait pour l’ostéoclastogenèse in vitro et l’ostéoblastogenesis. Les granules de GSK ont été administrés intragastriquement deux fois par jour aux rats pendant trois jours consécutifs. Le sang a ensuite été recueilli, centrifuge, inactivé et filtré. Enfin, le sérum a été dilué et utilisé pour effectuer l’ostéoclastogenèse et l’ostéoblastogenesis. Le protocole décrit ici peut être considéré comme une référence pour les études pharmacologiques des médicaments d’ordonnance à base de plantes, tels que les granules.
Introduction
La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est l’une des approches complémentaires et alternatives importantes pour traiter l’ostéoporose1,2. La décoction d’eau est la forme de base et la plus couramment utilisée de la formule3. Cependant, des inconvénients existent également : mauvais goût, inconvénients pour le transport, courte durée de conservation et protocoles incohérents, limitant les utilisations ainsi que les effets curatifs. Pour éviter les inconvénients ci-dessus ainsi que de poursuivre de meilleurs effets, granules ont été développés et ont été largement utilisés4. Bien que de nombreuses études aient exploré les mécanismes pharmacologiques d’un ou de plusieurs composants efficaces des granules5,6,7, les mécanismes exacts et les processus pharmacologiques sous-jacents sont encore difficile à identifier. C’est parce que trop de composants efficaces d’un granule peuvent simultanément exercer des effets similaires ou opposés4. Par conséquent, le développement d’un protocole standard pour préparer les granules avant de livrer à l’organisme aurait non seulement un grand impact sur les résultats thérapeutiques, mais est également nécessaire pour les essais in vivo et in vitro.
En outre, les effets curatifs des granules dans la clinique sont difficiles à confirmer et à identifier exactement à l’aide d’études in vitro ou ex vivo, ce qui crée un défi parce que les mécanismes pharmacologiques sont trop complexes. Pour résoudre ce problème, la préparation du sérum contenant des médicaments a été proposée pour la première fois par Tashino dans les années 19808. Dès lors, de nombreux chercheurs ont appliqué le sérum contenant des médicaments à la phytothérapie, y compris les granules9,10,11. Actuellement, le choix du sérum contenant des médicaments pour les enquêtes in vitro est considéré comme une stratégie qui imite étroitement les conditions physiologiques.
Les granules de Gushukang (GSK) ont été développés pour traiter l’ostéoporose postménopausique (POP) basée sur la pratique clinique à la lumière de la théorie de TCM. Les granules de GSK empêchent la perte d’os dans les souris ovariectomized (OVX) in vivo, inhibent la résorption osteoclastic d’os, et stimulent la formation osteoblastic d’os4. Par conséquent, Li et coll.12 ont constaté que les granules de GSK ont des effets protecteurs osseux chez les souris OVX en améliorant les activités du récepteur du calcium pour stimuler la formation osseuse. Pour confirmer les effets os-protecteurs aussi bien que les effets pharmacologiques des granules de GSK, les auteurs fournissent ici une procédure détaillée pour la préparation des solutions de travail et du sérum de drogue (GSK granule). En outre, cet article décrit l’application des granules de GSK dans un modèle osteoporotic de souris OVX-induit et le sérum de granule-contenant de GSK pour l’osteoclastogenesis/osteoblastogenesis in vitro.
Les granules DE GSK sont composés de plusieurs herbes13,14 et peuvent être complètement dissous dans saline facilement. Par conséquent, saline sert de véhicule. Les souris opérées par Sham (Sham) et LES souris OVX ont été administrées le même volume de saline que les souris administrées par les granulés. Les doses équivalentes de granules GSK pour la souris ont été calculées sur la base de l’équation Meeh-Rubner15. Cette équation a non seulement l’avantage d’obtenir des doses sûres, mais garantit également des effets pharmacologiques15. Les trois doses de granules GSK ont été générées comme suit: (1) GSKL: OVX – granules GSK à faible dose, 2 g/kg/jour. (2) GSKM : OVX et granules GSK à dose moyenne, 4 g/kg/jour. (3) GSKH : OVX et granules GSK à forte dose, 8 g/kg/jour. Des souris dans les groupes gskL, GSKM et GSKH ont été administrées intragastriquement des granules de GSK. Le carbonate de calcium (600 mg/comprimé) avec vitamine D3 (125 unité/comprimé international), par exemple, dans un produit mature et commercialisé (p. ex., Caltrate [CAL]) pour le traitement et la prévention de l’ostéoporose, a été utilisé comme un contrôle positif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Granules d’agents TCM sont devenus l’un des choix communs pour les formulations ou les prescriptions. Les granules de GSK sont composés de plusieurs plantes médicinales basées sur des expériences cliniques ou la théorie de la MTC, et ils exercent de meilleurs effets curatifs avec moins d’effets secondaires4. Par rapport à la décoction de l’eau, les granules ont ces avantages : bon goût, commodité de livraison, stockage à long terme, protocole standard et effets curatifs cohérents, ainsi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, et 81330085), le programme pour l’équipe innovante, le ministère des Sciences et de la Technologie de la Chine (2015RA4002 à WYJ), le programme pour Équipe innovante, Ministère de l’éducation de la Chine (IRT1270 à WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 à WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), et projets nationaux clés de développement de la recherche (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
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