Preparación de gránulos Gushukang (GSK) para experimentos in Vivo e In Vitro
Summary
Este artículo proporciona un protocolo detallado para preparar una solución de trabajo de gránulos Gushukang para estudios en animales y gránulo GSK que contiene suero para experimentos in vitro. Este protocolo se puede aplicar a las investigaciones farmacológicas de medicamentos a base de hierbas, así como a las prescripciones para experimentos in vivo e in vitro.
Abstract
La medicina herbaria tradicional china desempeña un papel como método alternativo en el tratamiento de muchas enfermedades, como la osteoporosis posmenopáusica (POP). Gushukang (GSK) gránulos, una receta comercializada en China, tienen efectos protectores óseos en el tratamiento de POP. Antes de la administración al cuerpo, un procedimiento de preparación estándar es comúnmente necesario, que tiene como objetivo promover la liberación de componentes activos de hierbas crudas y mejorar los efectos farmacológicos, así como resultados terapéuticos. Este estudio propone un protocolo detallado para el uso de gránulos GSK in vivo y ensayos experimentales in vitro. Los autores proporcionan primero un protocolo detallado para calcular las dosis apropiadas para animales de gránulos para la investigación in vivo: pesaje, disolución, almacenamiento y administración. En segundo lugar, en este artículo se describen los protocolos para la exploración de micro-CT y la medición de parámetros óseos. Se evaluaron la preparación de muestras, los protocolos para ejecutar la máquina de micro-CT y la cuantificación de los parámetros óseos. En tercer lugar, se preparan gránulos GSK que contienen suero y se extrae suero que contiene fármacos para la osteoclastogénesis in vitro y la osteoblastogénesis. Los gránulos GSK se administraron intragástricamente dos veces al día a ratas durante tres días consecutivos. Luego se recogió sangre, se centrifugaba, se inactivan y se filtró. Finalmente, el suero se diluyó y se utilizó para realizar osteoclastogénesis y osteoblastogénesis. El protocolo descrito aquí puede considerarse una referencia para las investigaciones farmacológicas de medicamentos recetados a base de hierbas, como gránulos.
Introduction
La medicina tradicional china (TCM) es uno de los importantesenfoques complementarios y alternativos para tratar la osteoporosis 1,2. La decocción de agua es la formabásica y más utilizada de la fórmula 3. Sin embargo, también existen inconvenientes: mal gusto, inconvenientes para el transporte, vida útil corta y protocolos inconsistentes, limitando los usos, así como los efectos curativos. Para evitar las desventajas anteriores, así como para perseguir mejores efectos, gránulos fueron desarrollados y se han utilizado ampliamente4. Aunque muchos estudios han explorado los mecanismos farmacológicos de uno o más componentes eficaces de los gránulos5,6,7, los mecanismos exactos y los procesos farmacológicos subyacentes siguen difícil de identificar. Esto se debe a que demasiados componentes efectivos de un gránulo pueden ejercer simultáneamente efectos similares u opuestos4. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo estándar para preparar los gránulos antes de entregar al cuerpo no sólo tendría un gran impacto en los resultados terapéuticos, sino que también es necesario para ensayos in vivo e in vitro.
Además, los efectos curativos de los gránulos en la clínica son difíciles de confirmar e identificar exactamente mediante estudios in vitro o ex vivo, lo que crea un desafío porque los mecanismos farmacológicos son demasiado complejos. Para resolver esto, la preparación del suero que contiene drogas fue propuestapor primera vez por Tashino en 1980 8 . A partir de entonces, numerosos investigadores aplicaron suero que contiene drogas a la medicina herbaria, incluyendo gránulos9,10,11. Actualmente, la elección del suero que contiene fármacos para las investigaciones in vitro se considera como una estrategia que imita de cerca las condiciones fisiológicas.
Los gránulos Gushukang (GSK) fueron desarrollados para tratar la osteoporosis posmenopáusica (POP) basándose en la práctica clínica a la luz de la teoría de la MTC. Los gránulos GSK previenen la pérdida ósea en ratones ovariectomizados (OVX) in vivo, inhiben la resorción ósea osteoclástica y estimulan la formación ósea osteoblástica4. En consecuencia,12 encontró que los gránulos GSK tienen efectos protectores óseos en ratones OVX al mejorar las actividades del receptor de calcio para estimular la formación ósea. Para confirmar los efectos protectores óseos, así como los efectos farmacológicos de los gránulos GSK, los autores proporcionan aquí un procedimiento detallado para la preparación de soluciones de trabajo y suero que contiene medicamentos (gránulos GSK). Además, este artículo describe la aplicación de gránulos GSK en un modelo de ratón osteoporótico inducido por OVX y suero que contiene gránulos gránulo para osteoclastogénesis in vitro/osteoblastogénesis.
GSK gránulos se componen de varias hierbas13,14 y se pueden disolver completamente en solución salina fácilmente. Por lo tanto, la salina sirve como el vehículo. A los ratones operados por Sham (Sham) y a los ratones OVX se les administró el mismo volumen de salina que a los ratones administrados por gránulos. Las dosis equivalentes de gránulos GSK para el ratón se calcularon sobre la base de la ecuación15de Meeh-Rubner. Esta ecuación no sólo tiene la ventaja de obtener dosis seguras, sino que también garantiza efectos farmacológicos15. Las tres dosis de gránulos GSK se generaron de la siguiente manera: (1) GSKL: OVX + gránulos GSK de dosis baja, 2 g/kg/día. (2) GSKM: OVX + gránulos GSK de dosis media, 4 g/kg/día. (3) GSKH: OVX + gránulos GSK de alta dosis, 8 g/kg/día. Los ratones de los grupos GSKL, GSKM y GSKH recibieron gránulos GSK administrados por tragastrically. El carbonato de calcio (600 mg/tableta) con vitamina D3 (125 unidad/tableta internacional), por ejemplo, en un producto maduro y comercializado (por ejemplo, Caltrate [CAL]) para tratar y prevenir la osteoporosis, se utilizó como un control positivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los gránulos de agentes de MTC se han convertido en una de las opciones comunes para formulaciones o recetas. GSK gránulos se componen de varios medicamentos herbarios basados en experiencias clínicas o la teoría de la MTC, y ejercen mejores efectos curativos con menos efectos secundarios4. En comparación con la decocción de agua, los gránulos tienen estas ventajas: buen gusto, comodidad de entrega, almacenamiento a largo plazo, protocolo estándar y efectos curativos consistentes, así com…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 y 81330085), el programa de Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología Equipo Innovador, Ministerio de Educación de China (IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 a WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y proyectos nacionales clave de desarrollo de la investigación (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Riferimenti
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