Beredning av Gushukang (GSK) granulat för in vivo-och in vitro-experiment
Summary
Denna artikel innehåller ett detaljerat protokoll för beredning av en fungerande lösning av Gushukang granulat för djurstudier och GSK granule som innehåller serum för in vitro-experiment. Detta protokoll kan tillämpas på farmakologiska undersökningar av växtbaserade läkemedel samt recept för både in vivo-och in vitro-experiment.
Abstract
Traditionell kinesisk örtmedicin spelar en roll som en alternativ metod vid behandling av många sjukdomar, såsom postmenopausala osteoporos (POP). Gushukang (GSK) granulat, ett marknadsfört recept i Kina, har ben skyddande effekter vid behandling av POP. Före administrering till kroppen, en standard beredning förfarande är vanligen krävs, som syftar till att främja frisättningen av aktiva beståndsdelar från råa örter och förbättra de farmakologiska effekterna samt terapeutiska resultat. I denna studie föreslås ett detaljerat protokoll för användning av GSK-granulat i experimentella analyser in vivo och in vitro. Författarna ger först ett detaljerat protokoll för att beräkna djur-lämpliga doser av granulat för in vivo undersökning: vägning, upplösning, lagring, och administration. För det andra beskriver den här artikeln protokoll för mikrodatortomografi och mätning av ben parametrar. Provberedning, protokoll för att köra mikro-CT-maskin och kvantifiering av ben parametrar utvärderades. Tredje, serum innehållande GSK granulat bereds, och läkemedelhaltiga serum extraheras för in vitro osteoclastogenes och osteoblastogenes. GSK granulat var intragastrically administreras två gånger per dag till råttor under tre dagar i följd. Blod samlades sedan in, centrifugeras, inaktiveras och filtreras. Slutligen, serum späddes och används för att utföra osteoclastogenes och osteoblastogenes. Det protokoll som beskrivs här kan betraktas som en referens för farmakologiska undersökningar av växtbaserade receptbelagda läkemedel, såsom granulat.
Introduction
Traditionell kinesisk medicin (TCM) är en av de viktiga komplementära och alternativa metoder för att behandla osteoporos1,2. Vatten dekokt är den grundläggande och mest använda formen av formel3. Men nackdelar finns också: dålig smak, olägenhet för transport, kort hållbarhetstid och inkonsekvent protokoll, begränsa användningsområden samt läkande effekter. För att undvika ovanstående nackdelar samt att fullfölja bättre effekter, granulat utvecklades och har använts i stor utsträckning4. Även om många studier har undersökt farmakologiska mekanismer för en eller flera effektiva komponenter från granulatet5,6,7, de exakta mekanismerna och underliggande farmakologiska processer är fortfarande svårt att identifiera. Detta beror på att alltför många effektiva komponenter från en granule kan samtidigt utöva liknande eller motsatta effekter4. Därför, utvecklingen av ett standardprotokoll för att förbereda granulerna innan de levereras till kroppen inte bara skulle ha en stor inverkan på de terapeutiska resultaten men krävs också för både in vivo och in vitro-analyser.
Dessutom är de läkande effekterna av granulat på kliniken svåra att bekräfta och exakt identifiera med hjälp av in vitro-eller ex vivo-studier, vilket skapar en utmaning eftersom de farmakologiska mekanismerna är för komplexa. För att lösa detta, beredning av läkemedel som innehåller serum föreslogs först av Tashino i 1980-talet8. Från och med då, många forskare tillämpade läkemedelhaltiga serum till örtmedicin, inklusive granulat9,10,11. För närvarande, valet av läkemedel som innehåller serum för in vitro-undersökningar betraktas som en strategi som nära härmar fysiologiska tillstånd.
Gushukang (GSK) granulat utvecklades för att behandla postmenopausala osteoporos (POP) baserat på klinisk praxis i ljuset av teorin om TCM. GSK granulat förhindra benförlust hos ovariectomized (OVX) möss in vivo, hämmar osteoklastisk benresorption, och stimulera osteoblastiska benbildning4. Följaktligen fann Li et al.12 att GSK granulat har ben skyddande effekter i OVX möss genom att öka verksamheten i kalcium receptor för att stimulera benbildning. För att bekräfta ben skyddande effekter samt de farmakologiska effekterna av GSK granulat, författarna här ger ett detaljerat förfarande för beredning av arbetslösningar och Drug (GSK granule)-innehållande serum. I denna artikel beskrivs dessutom tillämpningen av GSK-granulat i en OVX-inducerad modell av osteoporotisk mus och GSK-granule-innehållande serum för in vitro-osteoclastogenes/osteoblastogenes.
GSK granulat består av flera örter13,14 och kan helt lösas i saltlösning lätt. Därför är saltlösning fungerar som fordonet. Simulerad mus (Sham) och OVX-möss administrerades i samma volym av saltlösning som de granule-administrerade mössen. De ekvivalentdoserna av GSK-granulat för musen beräknades utifrån meeh-Rubner ekvation15. Denna ekvation har inte bara fördelen av att få säkra doser men också garantier farmakologiska effekter15. De tre doserna av GSK granulat genererades enligt följande: (1) GSKL: OVX + lågdos GSK granulat, 2 g/kg/dag. (2) GSKM: OVX + medelstora GSK granulat, 4 g/kg/dag. (3) GSKH: OVX + hög dos GSK granulat, 8 g/kg/dag. Möss i grupperna GSKL, GSKM och GSKH var intragastriskt administrerade GSK-granulat. Kalciumkarbonat (600 mg/tablett) med vitamin D3 (125 internationell enhet/tablett), till exempel, i en mogen och marknadsförs produkt (t. ex., Caltrate [CAL]) för behandling och förebyggande av osteoporos, användes som en positiv kontroll.
Protocol
Representative Results
Discussion
Granulat av TCM-medel har blivit ett av de vanligaste valen för formuleringar eller recept. GSK granulat består av flera växtbaserade läkemedel baserade på kliniska erfarenheter eller TCM teorin, och de utövar bättre läkande effekter med färre biverkningar4. Jämfört med vatten dekokt, granulatet har dessa fördelar: god smak, bekvämlighet för leverans, långsiktig lagring, standardprotokoll och konsekventa läkande effekter, samt högre produktivitet. För närvarande granulat är en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 och 81330085), programmet för innovativa team, ministeriet för vetenskap och teknik i Kina (2015RA4002 till WYJ), programmet för Innovativt team, Undervisningsministeriet i Kina (IRT1270 till WYJ), Shanghai TCM Medical Center of kronisk sjukdom (2017ZZ01010 till WYJ), tre år åtgärder för att påskynda utvecklingen av traditionell kinesisk medicin plan (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 till WYJ), och nationella centrala forsknings utvecklings projekt (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Riferimenti
- Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).
- Zhao, D., et al. The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice. Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).
- Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments. Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).
- Wang, Q., et al. The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).
- Bian, Q., et al. Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro. Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).
- Zhao, D., et al. Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis. Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).
- Tang, D. Z., et al. Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of β-Catenin-BMP Signaling. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).
- Tashino, S. “Serum pharmacology” and “serum pharmaceutical chemistry”: from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).
- Fu, L., et al. Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).
- Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice. Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).
- Cui, S. Q., et al. Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis. Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).
- Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study. Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).
- Zhang, Y. P. . Pharmacology Experiment. , (1996).
- Zhao, D. F., et al. Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis. Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Zhang, D. Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human). Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors’ expression in endothelial cells. Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y. K. Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Pacifici, R. Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis. Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).
- Ammann, P., et al. Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency. Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).
- Kimble, R. B., et al. Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period. Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).
