Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments
Summary
Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung einer Arbeitslösung von Gushukang-Granulat für Tierstudien und GSK-Granulat, das Serum für In-vitro-Experimente enthält. Dieses Protokoll kann auf pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen Arzneimitteln sowie auf Verschreibungen für In-vivo- und In-vitro-Experimente angewendet werden.
Abstract
Die traditionelle chinesische Kräutermedizin spielt eine Rolle als alternative Methode bei der Behandlung vieler Krankheiten, wie postmenopausale Osteoporose (POP). Gushukang (GSK) Granulat, ein vermarktetes Rezept in China, haben knochenschützende Wirkung bei der Behandlung von POP. Vor der Verabreichung an den Körper, ein Standard-Vorbereitungsverfahren ist allgemein erforderlich, die die Freisetzung von aktiven Bestandteilen aus Rohkräutern fördern und die pharmakologischen Wirkungen sowie therapeutische Ergebnisse zu verbessern. Diese Studie schlägt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von GSK-Granulat in in vivo- und in vitro-Experimentellen Assays vor. Die Autoren liefern zunächst ein detailliertes Protokoll zur Berechnung der tiergerechten Dosierungen von Granulaten für in vivo-Untersuchungen: Wiegen, Auflösen, Lagern und Verstoffen. Zweitens werden in diesem Artikel Protokolle für Mikro-CT-Scans und die Messung von Knochenparametern beschrieben. Die Probenvorbereitung, Protokolle zum Betrieb der Mikro-CT-Maschine und die Quantifizierung der Knochenparameter wurden ausgewertet. Drittens werden serumhaltige GSK-Granulate hergestellt und medikamentenhaltiges Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese extrahiert. GSK-Granulat wurde zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden Tagen intragastrisch an Ratten verabreicht. Anschließend wurde Blut entnommen, zentrifugiert, inaktiviert und gefiltert. Schließlich wurde Serum verdünnt und zur Durchführung von Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet. Das hier beschriebene Protokoll kann als Referenz für pharmakologische Untersuchungen von verschreibungspflichtigen pflanzlichen Arzneimitteln wie Granulaten betrachtet werden.
Introduction
Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist einer der wichtigen ergänzenden und alternativen Ansätze zur Behandlung von Osteoporose1,2. Wasserabkochung ist die grundlegende und am häufigsten verwendete Form der Formel3. Es gibt jedoch auch Nachteile: schlechter Geschmack, Unannehmlichkeiten für den Transport, kurze Haltbarkeit und inkonsistente Protokolle, Begrenzung der Verwendungen sowie die heilende Wirkung. Um die oben genannten Nachteile zu vermeiden und um bessere Effekte zu erzielen, wurden Granulate entwickelt und weit verbreitet4verwendet. Obwohl viele Studien die pharmakologischen Mechanismen einer oder mehrerer wirksamer Komponenten aus dem Granulat5,6,7untersucht haben, sind die genauen Mechanismen und zugrunde liegenden pharmakologischen Prozesse schwer zu identifizieren. Dies liegt daran, dass zu viele effektive Komponenten aus einem Granulat gleichzeitig ähnliche oder entgegengesetzte Effekte ausüben können4. Daher würde die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Vorbereitung des Granulats vor der Lieferung an den Körper nicht nur einen großen Einfluss auf die therapeutischen Ergebnisse haben, sondern ist auch für In-vivo- und In-vitro-Assays erforderlich.
Darüber hinaus sind die heilenden Wirkungen von Granulaten in der Klinik schwer zu bestätigen und anhand von In-vitro- oder Ex-vivo-Studien genau zu identifizieren, was eine Herausforderung schafft, da die pharmakologischen Mechanismen zu komplex sind. Um dies zu lösen, wurde die Herstellung von drogenhaltigem Serum zuerst von Tashino in den 1980er Jahrenvorgeschlagen 8. Von da an wandten zahlreiche Forscher medikamentenhaltiges Serum auf die Kräutermedizin an, einschließlich Granulat9,10,11. Derzeit wird die Wahl des medikamentenhaltigen Serums für In-vitro-Untersuchungen als eine Strategie betrachtet, die physiologische Bedingungen genau nachahmt.
Gushukang (GSK) Granulat wurde entwickelt, um postmenopausale Osteoporose (POP) auf der Grundlage der klinischen Praxis im Lichte der Theorie der TCM zu behandeln. GSK-Granulat verhindert Knochenverlust bei ovariectomisierten (OVX) Mäusen in vivo, hemmt die osteoklastische Knochenresorption und stimuliert die osteoblastische Knochenbildung4. Daher fanden Li et al.12 heraus, dass GSK-Granulate bei OVX-Mäusen Knochenschutzwirkungen haben, indem sie die Aktivitäten des Calciumrezeptors zur Stimulierung der Knochenbildung verbessern. Zur Bestätigung der knochenschützenden Wirkungen sowie der pharmakologischen Wirkungen von GSK-Granulat stellen die Autoren hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von Arbeitslösungen und Medikamenten (GSK-Granulat) -haltigem Serum zur Verfügung. Darüber hinaus beschreibt dieser Artikel die Anwendung von GSK-Granulat in einem OVX-induzierten osteoporotischen Mausmodell und GSK-Granulat-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese/Osteoblastogenese.
GSK-Granulat besteht aus mehreren Kräutern13,14 und kann leicht in Derinline gelöst werden. Daher dient Saline als Fahrzeug. Scheinoperierte Mäuse (Sham) und OVX-Mäuse wurden das gleiche Volumen an Salin verabreicht wie die mit Granulat verabreichten Mäuse. Die Äquivalentdosen von GSK-Granulat für die Maus wurden auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15berechnet. Diese Gleichung hat nicht nur den Vorteil, sichere Dosierungen zu erhalten, sondern garantiert auch pharmakologische Effekte15. Die drei Dosierungen von GSK-Granulat wurden wie folgt erzeugt: (1) GSKL: OVX + niedrig dosierte GSK-Granulate, 2 g/kg/Tag. (2) GSKM: OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat, 4 g/kg/Tag. (3) GSKH: OVX + hochdosiertes GSK-Granulat, 8 g/kg/Tag. Mäuse in den GSKL-, GSKM- und GSKH-Gruppen wurden intragastrisch mit GSK-Granulat verabreicht. Als Positivkontrolle wurde beispielsweise Calciumcarbonat (600 mg/Tablette) mit Vitamin D3 (125 internationale Einheit/Tablette) in einem ausgereiften und vermarkteten Produkt (z. B. Caltrat [CAL]) zur Behandlung und Vorbeugung von Osteoporose verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Granulat von TCM-Agenten sind eine der gemeinsamen Entscheidungen für Formulierungen oder Rezepte geworden. GSK-Granulat besteht aus mehreren pflanzlichen Arzneimitteln auf der Grundlage klinischer Erfahrungen oder der TCM-Theorie, und sie üben bessere heilende Effekte mit weniger Nebenwirkungen4. Im Vergleich zur Wasserabkochung haben die Granulate folgende Vorteile: guter Geschmack, Lieferkomfort, Langzeitlagerung, Standardprotokoll und konsistente Heileffekte sowie höhere Produktivität. Der…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 und 81330085), das Programm für Innovatives Team, Ministerium für Wissenschaft und Technologie chinas (2015RA4002 bis WYJ), das Programm für Innovatives Team, Bildungsministerium Chinas (IRT1270 bis WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 bis WYJ), Dreijahre Aktion zur Beschleunigung der Entwicklung des Plans für traditionelle chinesische Medizin (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 bis WYJ) und nationalen wichtigsten Forschungsentwicklungsprojekte (2018YFC1704302).
Materials
| α-MEM | Hyclone laboratories |
SH30265.018 | For cell culture |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G5422 | Osteoblastogenesis |
| Caltrate (CAL) | Wyeth | L96625 | Animal interventation |
| C57BL/6 mice | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Ainimal preparation |
| Dexamethsome | Sigma | D4902 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2438 | Cell frozen |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Sangon Biotech | 60-00-4 | Samples treatmnet |
| Fetal bovine serum | Gibco | FL-24562 | For cell culture |
| Gushukang granules | kangcheng companyin china | Z20003255 | Herbal prescription |
| Light microscope | Olympus BX50 | Olympus BX50 | Images for osteoclastogenesis |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate | Sigma | A8960-5G | Osteoblastogenesis |
| Microscope | Leica | DMI300B | Osteocast and osteoblast imagine |
| M-CSF | Peprotech | AF-300-25-10 | Osteoclastogenesis |
| Μicro-CT | Scanco Medical AG |
μCT80 radiograph microtomograph | Bone Structural analsysis |
| RANKL | Peprotech | 11682-HNCHF | Osteoclastogenesis |
| Sprague Dawley | SLAC Laboratory Animal Co. Ltd. |
Random | Blood serum collection |
| Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | TRAP staining |
Riferimenti
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