Malignant en Non-Malignant B cellen isoleren uit lck:eGFP zebravis
Summary
Transgene lck:eGFP zebrafish express GFP zeer in T lymfocyten en zijn gebruikt voor het bestuderen van de T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie. Deze regel kan worden gebruikt voor studie B-cellen, die lck op lagere niveaus uitdrukken. Dit protocol beschrijft zuivering van kwaadaardige en niet-kwaadaardige B-cellen uit lck:eGFP zebrafish.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio) zijn een krachtig model om te studeren lymfocyt ontwikkeling. Zoals zoogdieren bezitten D. rerio een adaptieve immuunsysteem waarin B en T-lymfocyten. Studies van zebravis lymphopoiesis zijn moeilijk, omdat de antistoffen herkennen D. rerio cel oppervlakte markeringen zijn doorgaans niet beschikbaar, complicerende isolatie en karakterisatie van verschillende lymfocyt bevolking, met inbegrip van B-geslacht cellen. Transgene lijnen met geslacht-specifieke fluorophore expressie worden vaak gebruikt voor het omzeilen van deze uitdaging. De transgene lck:eGFP lijn is gebruikt voor het bestuderen van D. rerio T cel ontwikkeling en is ook gebruikt voor model T cel ontwikkeling en acute lymfatische leukemie (T-ALL). Hoewel lck:eGFP vis wijd gebruikt zijn voor het analyseren van de T-bloedlijn, zijn ze niet gebruikt om te studeren van B-cellen. Onlangs ontdekten we dat veel zebrafish B-cellen ook express lck, weliswaar op lagere niveaus. Lck:eGFP B cellen express bijgevolg eveneens lage niveaus van GFP. Op basis van deze bevinding, ontwikkeld wij een protocol om te zuiveren van B-bloedlijn cellen uit lck:eGFP zebrafish, die wij hier rapporteren. Onze werkwijze wordt beschreven hoe u gebruik maken van een TL-geactiveerde cel sorter (FACS) om te zuiveren van B-cellen van de lck:eGFP vis of verwante lijnen, zoals dubbel-transgene rag2:hMYC; lck:eGFP vis. In deze lijnen, B-cellen, zodat vooral onvolwassen B-cellen, uitdrukkelijke GFP op laag maar detecteerbare niveaus, ze kunnen worden onderscheiden van T-cellen, die zeer GFP uitdrukken. B cellen kunnen worden geïsoleerd uit het beenmerg, thymus, milt, bloed of andere weefsels. Dit protocol biedt een nieuwe methode om te zuiveren van D. rerio B-cellen, waardoor studies gericht op onderwerpen zoals B cel ontwikkeling en B-lymfocyt maligniteiten.
Introduction
Zebravis bieden krachtige kenmerken, zoals genetische oorlogsmachinerie, hoge vruchtbaarheid, optische translucentie en snelle ontwikkeling die studeren gewervelde ontwikkelen met behulp van genetische benaderingen te vergemakkelijken. Deze voordelen, samen met de gedeelde kenmerken van teleost en zoogdieren Haematopoiese, maken D. rerio ideaal voor in vivo analyses van lymphopoiesis en lymfocyt functie, vanaf hun vroegste verschijning in larven in de volwassenheid. Bloed ontwikkeling in zebrafish berust op goed geconserveerde genetische processen die worden gedeeld met zoogdieren, en deze uit te breiden naar het adaptieve immuunsysteem. Moleculaire mechanismen bestuur lymfoïde ontwikkeling zijn bovendien opmerkelijk bewaard tussen zebravis en zoogdieren1.
In de afgelopen 2 decennia, transgene D. rerio lijnen dat etiket specifieke bloed lineages en mutant lijnen tekort aan deze geslachten zijn2,3,4,5gemaakt. Een van deze, de transgene lijn van lck:eGFP , gebruikt de zebravis lymfocyt eiwit tyrosine kinase (lck) promotor voor GFP expressie6. Dit gen, die sterk wordt uitgedrukt door zowel T-bloedlijn precursoren en volwassen T-lymfocyten, kan in vivo bijhouden van de ontwikkeling van de serie T-cel en ex vivo zuivering van T-bloedlijn cellen door FACS7. Eerder, we gebruikten deze regel in een voorwaarts-genetische ENU mutagenese scherm te identificeren germline mutanten vatbaar voor T-ALL en te bestuderen somatically verworven genetische gebeurtenissen gekoppeld aan T cel oncogenese8,9.
Ons laboratorium verder breidden het nut van lck:eGFP zebrafish. In dubbel-transgene rag2:hMYC (menselijke MYC), lck:eGFP D. rerio waarvan bekend is dat het ontwikkelen van T-ALL 10, ontdekten we dat B-bloedlijn allemaal ook optreden11. In tegenstelling tot T-ALL in dit model, die lichten helder als gevolg van hoge GFP expressie, B-ALL zijn vaag-belichting fluorescerende als gevolg van lage GFP niveaus, waardoor vis met B-ALL te onderscheiden Grove van degenen met T-ALL door fluorescent microscopie. Deze differentiële GFP-expressie staat ook de scheiding van GFPlo B-ALL cellen van GFPHallo T-ALL cellen met behulp van FACS11. Bovendien, lage lck expressie is niet uniek voor zebrafish B-ALL, als menselijke B-ALL ook express lage niveaus van LCK11,12. Ook de normale B-bloedlijn cellen van D. rerio, muizen en mensen ook lage niveaus van lckexpress /Lck/LCK, met onrijpe B-cellen die de hoogste expressie11,13. Op basis van het per cel express B-bloedlijn cellen lckeGFP zebrafish of afgeleide regels 1-10% zoveel GFP als T-lymfocyten. Deze GFPlo cellen uitdrukkelijke karakteristiek B-cel mRNAs zoals pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, en anderen, en gezuiverd kan worden uit het beenmerg, thymus, milt of randapparaat bloed11. Daarom beide B – en T-bloedlijn cellen kunnen, geïsoleerd uit lckeGFP zebrafish, en in het geval van rag2hMYC, lckeGFP dieren, B – en T-ALL cellen ook11.
Hier presenteren we ons protocol naar efficiënt FACS-zuiveren niet-maligne B cellen van lck:eGFP zebrafish, en niet-kwaadaardige of kwaadaardige B-cellen van de rag2hMYC; lck:eGFP vis, met behulp van verschillende weefsels van de bron. Deze cellen kunnen eveneens worden gekwantificeerd door stroom cytometry zonder FACS isolatie, indien gewenst. Ontdekking van lage lck expressie- en dus lage GFP expressie-door B cellen opent nieuwe deuren voor experimentele mogelijkheden voor lckeGFP zebrafish, zoals in vivo B cel developmental studies. Dus, deze transgene lijn, eerst gemeld in 2004, heeft nieuw leven zoals we willen gebruiken om te achterhalen van de nieuwe inzichten inzake de zebravis adaptieve immuniteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wij bieden een protocol om te isoleren van de B-cellen uit lck:eGFP transgene zebrafish, het toevoegen van deze tot andere D. rerio modellen met B-bloedlijn etiketten3,4en ontwikkeld. Enigszins verrassend, ging de identificatie van GFPlo B cellen in deze lijn onopgemerkt sinds de bijbehorende beschrijving in 2004. In het algemeen lck wordt beschouwd als T-cel-specifieke6, maar recente studies gevonden …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zouden graag bedanken Megan Malone-Perez zebrafish ziekenverpleger, en de OUHSC stroom cytometry kern. Dit werk werd gesteund door subsidies van Hyundai Hope op wielen, het centrum van Oklahoma voor de vooruitgang van wetenschap en technologie (HRP-067), een pilot-project award van NIH/NIGMS INBRE (P20 GM103447). JKF houdt de E.L. & Thelma Gaylord begiftigd Chair in Pediatric hematologie-oncologie van het Children’s Hospital Foundation.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Riferimenti
- Paik, E. J., Zon, L. I. Hematopoietic development in the zebrafish. International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).
- Kasheta, M., et al. Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish. Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).
- Liu, X., et al. Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes. Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
- Schorpp, M., et al. Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish. Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).
- Langenau, D. M., et al. In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish. Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).
- Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
- Frazer, J. K., et al. Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen. Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Gutierrez, A., et al. Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia. Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).
- Borga, C., et al. Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis. Leukemia. , (2018).
- Haferlach, T., et al. Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group. Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).
- Novershtern, N., et al. Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis. Cell. 144 (2), 296-309 (2011).
- Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of the adult zebrafish. Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).
- Traver, D., et al. Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants. Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).
- Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
- Tang, Q., et al. Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).
