Lck:eGFP 제 브라에서에서 Malignant 및 비 Malignant B 세포 분리
Summary
유전자 변형 lck:eGFP zebrafish T 림프 톨에 GFP를 높게 표현 하 고 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병을 연구 하는 데 사용 되었습니다. 이 선 낮은 수준에서 lck 표현 연구 B 셀에 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜 lck:eGFP 제 브라에서 악성 및 비 악성 B 세포의 정화를 설명합니다.
Abstract
Zebrafish (Danio rerio)는 림프 구 개발을 공부 하는 강력한 모델입니다. 포유류 처럼, D. rerio B와 T 림프 톨을 포함 하는 적합 한 면역 계통을 소유. D. rerio 세포 표면 마커를 인식 하는 항 체는 일반적으로 분리 및 B 계보를 포함 하 여 다른 림프 구 인구의 특성을 복잡 하 게 사용할 수 없습니다 때문에 제 브라 lymphopoiesis의 연구는 어려운 셀입니다. 계보 특정 fluorophore 식 유전자 변형 라인 자주이 문제를 우회 하는 데 사용 됩니다. 유전자 변형 lck:eGFP 라인 D. rerio T 셀 개발, 연구 하는 데 사용 되었습니다 그리고 또한 모델 T 세포 개발 및 급성 림프 구성 백혈병 (T-모든) 활용 되었습니다. Lck:eGFP 물고기 널리 사용 되었습니다 T-계보를 분석, 하지만 그들은 하지 B 세포 연구에 사용 되었습니다. 최근, 우리가 발견 lck을 표현 하는 많은 zebrafish B 셀 낮은 수준에 쓰 신. 따라서, lck:eGFP B 세포는 마찬가지로 GFP의 저급을 표현 한다. 이에 따라, 우리 lck:eGFP zebrafish, 우리가 보고 여기에서 B 계보 세포를 정화 하는 프로토콜을 개발 했다. 우리의 방법은 정화 lck:eGFP 물고기 또는 이중 유전자 변형 rag2:hMYC; 등 관련된 라인에서 B 세포 형광 활성화 된 세포 분류 (FACS)를 활용 하는 방법을 설명 합니다. lck:eGFP 물고기입니다. 에이 라인, B 세포, 특히 미 성숙한 B 세포, 낮은 하지만 감지 수준 급행 GFP 그들 고유 높은 GFP를 표현 하는 T 세포에서 허용. B 세포는 골 수, 흉 선, 비장, 혈액, 또는 다른 조직 으로부터 격리 될 수 있습니다. 이 프로토콜에는 정화 D. rerio B 세포, B 세포 개발 및 B 림프 구 악성 같은 주제에 초점을 맞춘 연구를 활성화 하는 새로운 방법을 제공 합니다.
Introduction
Zebrafish는 강력한 특성, 유전자 manipulability, 높은 통치, 광학 반투명, 급속 한 발전 등 유전자 방법을 사용 하 여 공부 척추 개발을 용이 하 게 제공 합니다. Teleost 및 포유류 조의 공유 기능과 함께 이러한 장점을 D. rerio 애벌레 성인 기 동안에 그들의 가장 이른 외관에서 lymphopoiesis 및 림프 구 기능 vivo에서 분석에 적합 확인합니다. Zebrafish에 혈액 개발, 포유류와 공유 하는 잘 보존 유전 프로세스에 의존 하 고 이러한 적응형 면역 체계에 확장. 또한, 림프 개발을 경 세 하는 분자 메커니즘은 너무나 zebrafish 및 포유류1사이 보존 하 고.
지난 2 년간 유전자 변형 D. rerio 라인 그 레이블 특정 혈액 계보 그리고 돌연변이 라인 결핍이 계보에 생성 된2,3,,45. 이 lck:eGFP 유전자 변형 라인 중 하나 GFP 식6드라이브 zebrafish 림프 구 단백질 티로신 키 니 아 제 (lck) 발기인을 사용 하 여. 높은 T-혈통 선구자와 성숙한 T 세포에 의해 표현,이 유전자 vivo FACS7thymic T 세포 개발의 및 T-계보 세포의 생체 내 정화 전 추적에서 있습니다. 이전에 우리 사용이 줄 앞으로 유전 ENU mutagenesis 화면에 T-모든 경향이 생식 돌연변이 식별 하 고 somatically 인수 유전자 T 셀 발암8,9에 연결 된 이벤트를 공부 하.
최근, 우리 연구소는 더 lck:eGFP zebrafish의 유틸리티 확장. 이중 유전자 변형 rag2:hMYC (인간 MYC), T-모든 10, 개발 된 lck:eGFP D. rerio 에서 우리가 발견 B 계보도11를 발생 하는 모든. T-모든 높은 GFP 식 인해 밝은 형광,이 모델에서와 달리 B-모든은 어렴풋이 형광 수준 때문에 낮은 GFP, B-모든 구별 될 조잡 한 그 T-모든 형광 현미경 검사 법에 의해를 가진 물고기를 수 있도록. 이 차동 GFP 식 또한 허용 GFP로 B-모든 세포의 분리에서 GFP안녕하세요 FACS11를 사용 하 여 T-모든 셀. 또한, 낮은 lck 식 고유 하지 않습니다 제 B-전체, 브라를 LCK11,12의 인간의 B-모든 익스프레스 또한 낮은 수준으로. 마찬가지로, D. rerio, 쥐, 및 인간의 정상적인 B 계보 세포는 또한 lck의 저급을 표현 /LckLCK, 미 성숙한 B 세포와 데 높은 식11,13. 셀 당 기준 lckeGFP zebrafish 또는 파생 라인에 B 계보 세포 표현 1-10% 만큼 GFP T 림프 톨으로. 이러한 GFP로 표현 특성 등 pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighz, B 세포 mRNAs 세포와 골 수, 흉 선, 비장, 또는 주변에서 순화 될 수 있다 피11. 따라서, 둘 다 B-및 T-계보 세포 수 격리 lckeGFP zebrafish, 그리고 rag2hMYC, lckeGFP 동물, 뿐만 아니라 B 및 T 모든 셀의 경우11.
여기, 우리가 현재 우리의 프로토콜 효율적으로 FACS 정화 비 악성 B 세포에 lck:eGFP zebrafish, 및 rag2hMYC;의 비 악성 또는 악성 B 세포에서 lck:eGFP 물고기, 다양 한 소스 티슈를 사용 하 여. 원하는 경우 이러한 셀 마찬가지로 FACS 격리 없이 cytometry에 의해 측정할 수 수 있습니다. 낮은 lck 식의 발견-GFP 식 결과, 낮은-b 셀 비보 B 세포 발달 연구와 같은 lckeGFP zebrafish에 대 한 실험 가능성의 새로운 문의 엽니다. 따라서, 2004 년에 처음 보고 된이 유전자 변형 라인 우리가 추구 zebrafish 적응 면역에 관한 신선한 통찰력을 수집에 그것을 활용 새로운 생명이 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리가 개발 하 고이 B 계보 레이블3,4다른 D. rerio 모델에 추가 하는 것은 lck:eGFP 유전자 변형 zebrafish에서 B 세포 격리 프로토콜을 제공. 약간 의외로, GFP로 B 셀이이 라인의 식별이 갔다 2004 년에 그것의 설명부터 주목. 일반적으로, lck 는 T 세포 관련6, 간주 됩니다 하지만 최근 연구 발견 예기치 않은 lck…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 메 간 말론-페레즈 zebrafish 관리, 그리고 OUHSC 흐름 cytometry 코어를 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 현대 바퀴, 오클라호마 센터 발전의 과학 기술 (HRP-067), NIH/NIGMS INBRE 파일럿 프로젝트 수상 (P20 GM103447)에 대 한 희망에서 교부 금에 의해 지원 되었다. JKF 일정 & 델 마 게이 부여의 자에서 소아 혈액학-종양학 어린이 병원 재단의 보유합니다.
Materials
| 35 µm mesh | Sefar Filter technology | 7050-1220-000-13 | |
| 5 ml Polystyrene round-Bottom tube with cell-strainer cap | Falcon Corning Brand | 352235 | |
| 50 ml conical tube | VWR international | 525-0448 | |
| AZ APO 100 Fluorescent microscope | Nikon | ||
| Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| DS-Qi1MC camara | Nikon | ||
| Ethyl 3-aminobenzoate methansesulfonate; MS-222 | Sigma | E-10521 | |
| FACSJazz | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine Serum | Thermo Fisher | 10437028 | |
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC | ||
| lck:eGFP | See Langeneu et al., 2004 | ||
| NIS Elements software | Nikon | Version 4.13 | |
| Penicilin -Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Pestle micro-tube homogenizers | Electron Microscopy Sciences | 64788-20 | |
| Plastic Transfer pippetes | |||
| rag2:hMYC-ER | See Gutierrez et al., 2011 | ||
| RPMI Media 1640 1X | Life Technologies | 11835-030 |
Riferimenti
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