Een betrouwbare en reproduceerbare kritische middelgrote regiogebonden femorale Defect Model bij ratten gestabiliseerd met een aangepaste externe Fixator
Summary
In vivo zoogdieren modellen van kritische en middelgrote bot gebreken zijn essentieel voor de onderzoekers bestuderen van genezing mechanismen en orthopedische therapieën. Hier introduceren we een protocol voor de oprichting van femur, reproduceerbaar, Gesegmenteerde defecten in ratten gestabiliseerd met behulp van externe fixatie.
Abstract
Orthopedisch onderzoek leunt op dierlijke modellen bestuderen van mechanismen van bot in vivo genezing, alsook het onderzoeken van de nieuwe behandelingstechnieken. Kritische en middelgrote Gesegmenteerde defecten zijn uitdagend voor de behandeling van klinisch en onderzoeksinspanningen kunnen profiteren van een betrouwbare, ambulante kleine diermodel van een segmentale femorale defect. In deze studie presenteren wij een geoptimaliseerde chirurgische protocol voor het consistente en reproduceerbare creëren van een kritische diaphyseal defect 5 mm in een rat dijbeen gestabiliseerd met een externe fixator. De diaphyseal ostectomy werd uitgevoerd met behulp van een aangepaste mal te plaatsen 4 Kirschner draden bicortically, die werden gestabiliseerd met een aangepast externe fixator apparaat. Een oscillerende zaag bot werd gebruikt voor het maken van het gebrek. Een collageen spons alleen of een collageen spons, gedrenkt in rhBMP-2 het gebrek werd ingeplant en de genezing van de bot meer dan 12 weken met behulp van röntgenfoto’s werd gecontroleerd. Na 12 weken, ratten werden opgeofferd en histologische analyse werd uitgevoerd op het verwijderde besturingselement en dijbeen behandeld. Bot gebreken met alleen collageen spons resulteerde in non-adhesie, terwijl rhBMP-2 behandeling de vorming van een periosteal hardvochtig en nieuwe bot verbouwing leverde. Dieren goed herstelde na implantatie en externe fixatie succes in het stabiliseren van de femorale gebreken meer dan 12 weken. Deze gestroomlijnde chirurgische model kan gemakkelijk worden toegepast om te studeren bot genezing en testen van nieuwe orthopedische biomaterialen en regeneratieve therapieën in vivo.
Introduction
Orthopedisch trauma chirurgie richt zich op de behandeling van een breed scala van complexe fracturen. Kritische diaphyseal regiogebonden bot gebreken hebben bewezen moeilijk te behandelen klinisch als gevolg van het verminderde regeneratieve vermogen van de omliggende spier en het periosteum evenals het falen van gelokaliseerde angiogenese1. Moderne behandelingstechnieken omvatten operatieve fixatie met bottransplantaat, vertraagd bottransplantaat (Masquelet), bone vervoer, fusie of amputatie2,3,4. Bij de meeste patiënten hebben ambulante functie behouden na hun trauma, met goed functionerende distale ledematen, is ledemaat restwaarde duidelijk een betere behandeling optie5. Deze berging behandelingen vereisen vaak geënsceneerde chirurgische ingrepen in de loop van een lange behandeling. Sommige auteurs hebben gesuggereerd dat externe fixatie is superieur ten opzichte van de oppervlakte van de inwendige fixatie voor deze toepassingen als gevolg van de verminderde weefselschade tijdens de implantatie, daalde geïmplanteerd, en verhoogde postoperatieve verstelbaarheid van het fixatiemiddel6. Een prospectieve gerandomiseerde gecontroleerde trial is echter momenteel aan de gang om te helpen verduidelijken deze controverse van interne versus externe fixatie in ernstige open fracturen van de tibia7. Helaas bestaan belangrijke complicatie en mislukking tarieven met beide behandeling geselecteerd,8,9. Met beide methoden van de behandeling, met betrekking tot de gesegmenteerde botverlies, moet de chirurg kampen met segmentale diaphyseal gebreken die significante uitdagingen presenteren. Correcties van gesegmenteerde defecten moeten maximaliseren bot stabilisatie en tegelijkertijd het verbeteren van het proces van de osteogenic10,11.
Als gevolg van het klinische belang, maar het lagere volume, kritische en middelgrote diaphyseal Gesegmenteerde defecten, is een effectief, reproduceerbaar diermodel noodzakelijk om onderzoeksteams verder behandelingstechnieken en uiteindelijk klinische resultaten te verbeteren. Onderzoekers moeten bestuderen in vivo fysiologische genezing mechanismen in een diermodel voor zoogdieren. Hoewel dergelijke modellen van externe fixatie al bestaan12,13,14,15, hopen we om een betrouwbaarder methode voor niet-vakbonden in de onbehandelde dieren, daling van de kosten door de keuze van betaalbare fixatiemiddel materialen en het overzicht van een eenvoudige chirurgische protocol voor de gemakkelijke toepassing op toekomstige studies. Het hoofddoel van dit protocol is om een betrouwbare en reproduceerbare model van een kritische diaphyseal defect bij ratten. De procedure werd door de beoordeling van de stabilisatie en het bot genezing in rat dijbeen meer dan 12 weken beoordeeld. De secundaire doelstellingen opgenomen: waardoor een betaalbare model als een rendabel mogelijk, vereenvoudiging van de chirurgische benadering en stabilisatie, en het waarborgen van ethische verzorging van de dieren. De auteurs en het onderzoeksteam verricht voorbereidende experimenten met een aantal verschillende biomaterialen en potentiële regeneratieve therapieën om genezing in dit segment defect.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kleine dierlijke modellen van orthopedische letsels zoals volledige botbreuken inschakelen onderzoek dat de mechanismen voor osteogenesis en beoordeling van de therapeutische mogelijkheden van biomaterialen20verkent. Deze studie introduceert een rat regiogebonden defect model gestabiliseerd door een aangepaste externe fixator die een lab en biomedische technologie team gemakkelijk voor verdere studies van dragende osteosynthetic bot reparatie reproduceren kan.
Eerdere s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van NIH apparatuur 1S10OD023676-01 met extra ondersteuning geboden via de Universiteit van Wisconsin afdelingen van orthopedie en revalidatie en School van geneeskunde en de volksgezondheid. Wij wensen te erkennen van de UW Carbone Cancer Center ondersteunen Grant P30 CA014520 en het gebruik van hun kleine dier Imaging faciliteit, evenals de NIH opleiding Grant 5T35OD011078-08 voor ondersteuning van H. Martin. Wij danken ook Michael en Mary Sue Shannon voor hun steun aan het spier-en regeneratie-partnerschap.
Materials
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2×2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4×4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
Riferimenti
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, &. #. 3. 2. 1. ;., Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R. The mechanics of external fixation. The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery. 3 (1), 13-29 (2007).
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children’s Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- . . Living lmage Software. , (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
