En pålitelig og reproduserbar kritisk størrelse Segmentinformasjon femur feil modell i rotter stabilisert med en egendefinert eksterne Fixator
Summary
I vivo pattedyr modeller av kritisk-størrelse bein mangler er viktig for forskerne studere helbredende mekanismer og Ortopedisk behandling. Her introduserer vi en protokoll for etableringen av reproduserbar, Segmentinformasjon, femur defekter i rotter stabilisert bruker eksterne fiksering.
Abstract
Ortopedisk forskning stoler tungt på dyremodeller å studere mekanismer av bein i vivo , samt undersøke nye behandlingsteknikker. Kritisk størrelse Segmentinformasjon defekter er utfordrende for å behandle klinisk og forskningsinnsats kan ha nytte av en pålitelig, ambulerende liten dyr modell av en Segmentinformasjon femur defekt. I denne studien presenterer vi en optimalisert kirurgisk protokoll for konsekvent og reproduserbar etableringen av 5 mm kritiske diaphyseal feil i en rotte femur stabilisert med en ekstern fixator. Diaphyseal ostectomy ble utført ved hjelp av en egendefinert gigg plassere 4 Kirschner ledninger bicortically, som var stabilisert med en tilpasset eksterne fixator enhet. En oscillerende bein sagen ble brukt til å opprette feilen. En kollagen svamp alene eller en kollagen svamp dynket i rhBMP-2 ble implantert i feilen, og bein helbredelsen var overvåket over 12 uker med radiographs. Etter 12 uker, rotter ble ofret, og histologiske analyse var utført på kontrollen forbrukeravgift og behandlet femurs. Bein defekter som inneholder bare kollagen svamp resulterte i ikke-union, mens rhBMP-2 behandling gitt dannelsen av en periostal ufølsom og nye Ben-nydannelse. Dyr gjenopprettede godt etter implantasjon, og eksterne fiksering vist seg vellykket i å stabilisere femur defekter over 12 uker. Denne strømlinjeformet kirurgisk modellen kan lett brukes for å studere bein healing og teste nye Ortopedisk biologisk materiale og regenerativ Therapy i vivo.
Introduction
Ortopedisk traumer kirurgi fokuserer på behandling av en rekke komplekse frakturer. Kritisk diaphyseal Segmentinformasjon bein mangler har vist seg vanskelig å behandle klinisk på grunn av redusert regenerativ evne til omkringliggende muskler og periosteum samt mislykkede lokalisert angiogenese1. Moderne behandlingsteknikker inkluderer operative fiksering med Bentransplantering, forsinket Bentransplantering (Masquelet), bein transport, fusjon eller amputasjon2,3,4. I de fleste pasienter som har ambulerende funksjonen bevart etter sine traumer, med velfungerende distale lemmer, er lem restverdi klart en bedre behandling alternativet5. Disse berge behandlinger krever ofte trinnvis kirurgiske inngrep over en lang behandlingsperiode. Noen forfattere har antydet at eksterne fiksering er overlegen i forhold til den interne fiksering for disse programmene på grunn av redusert tissue skaden under implantasjon, redusert implantert areal, og økt postoperativ justering av fixator6. Imidlertid er en potensiell randomisert kontrollert studie for tiden i gang å avklare denne kontroversen interne versus eksterne fiksering i alvorlig åpent brudd i tibia7. Dessverre, med enten behandling valgt, betydelig komplikasjon og feil priser vedvarer8,9. Med enten behandlingsmetode, med hensyn til Segmentinformasjon bein tapet, må kirurgen kjempe med Segmentinformasjon diaphyseal defekter som betydelige utfordringer. Rettelser Segmentinformasjon feil må maksimere bein stabilisering og samtidig forbedre den osteogenic prosess10,11.
På grunn av klinisk betydning, men det lavere volumet, kritisk størrelse diaphyseal Segmentinformasjon defekter, er et effektivt, reproduserbare dyremodell nødvendig å aktivere forskergrupper å fremme behandlingsteknikker og til slutt bedre kliniske utfall. Forskerne trenger å studere i vivo fysiologiske helbredende mekanismer i et pattedyr dyremodell. Mens slike modeller av eksterne fiksering allerede finnes12,13,14,15, håper vi å gi en sikrere metode for ikke-fagforeninger i ubehandlet dyrene, redusere kostnader gjennom valg av rimelig fixator materialer og disposisjon en direkte kirurgisk protokoll for lett programmet til fremtidige studier. Hovedmålet med denne protokollen er å etablere en pålitelig og reproduserbar modell av en kritisk diaphyseal feil i rotter. Prosedyren ble evaluert av taksere stabilisering og bein healing i rotte femurs over 12 uker. Sekundær målene inkludert: gjør en rimelig modell som en kostnadseffektiv som mulig, forenkle kirurgisk tilnærming og stabilisering, og sikre etiske av dyrene. Forfattere og forskningsteam gjennomført foreløpige eksperimenter med en rekke forskjellige biologisk materiale og potensielle regenerativ Therapy å forbedre healing i denne Segmentinformasjon defekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Små dyr modeller av Ortopedisk skader som fullstendig benbrudd aktiverer forskning som utforsker mekanismer for osteogenesis og vurdere terapeutiske potensialet i biologisk materiale20. Denne studien introduserer rotte Segmentinformasjon feil modell stabiliseres av en egendefinert eksterne fixator som en lab og biomedisinsk engineering team kan lett reprodusere for videre studier av bærende osteosynthetic bein reparasjon.
Tidligere studier med kritisk størrelse defek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en NIH utstyr Grant 1S10OD023676-01 med ekstra støtte University of Wisconsins avdelinger av ortopedi og rehabilitering og School of Medicine og folkehelse. Vi ønsker å erkjenne UW’S Carbone Cancer Center støtte Grant P30 CA014520 og bruk av deres liten dyr Imaging anlegg, samt NIH trening Grant 5T35OD011078-08 for støtte av H. Martin. Vi takker også Michael og Mary Sue Shannon for deres støtte av muskel gjenfødelse partnerskap.
Materials
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2×2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4×4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
Riferimenti
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, &. #. 3. 2. 1. ;., Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R. The mechanics of external fixation. The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery. 3 (1), 13-29 (2007).
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children’s Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- . . Living lmage Software. , (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
