En pålidelig og reproducerbar kritiske mellemstore Segmental Femoral defekt Model i rotter stabiliseret med en brugerdefineret ekstern fiksator
Summary
In vivo pattedyr modeller af kritiske mellemstore knogledefekter er afgørende for forskere studerer helbredende mekanismer og ortopædiske behandlingsformer. Her introducerer vi en protokol til oprettelse af reproducerbar, segmental, collum defekter i rotter stabiliseret ved hjælp af eksterne fiksering.
Abstract
Ortopædiske forskning er stærkt afhængig af dyremodeller for at studere mekanismer af knogle heling i vivo samt undersøge de nye behandlingsteknikker. Kritisk mellemstore segmental defekter udfordrende for at behandle klinisk, og forskningsindsatsen kunne drage fordel af en pålidelig, ambulante lille dyremodel af en segmental femoral defekt. I denne undersøgelse præsenterer vi en optimeret kirurgisk protokol for konsekvent og reproducerbar oprettelsen af en 5 mm kritiske diaphyseal defekt i en rotte lårbenet stabiliseret med ekstern fiksator. Den diaphyseal ostectomy blev udført ved hjælp af en brugerdefineret jig for at placere 4 Kirschner ledninger bicortically, som var stabiliseret med en tilpasset ekstern fiksator enhed. En oscillerende knogle så blev brugt til at oprette defekten. Enten en kollagen svamp alene eller en kollagen svamp dyppet i rhBMP-2 blev implanteret i defekten, og den knogleheling blev overvåget over 12 uger ved hjælp af røntgenbilleder. Efter 12 uger, rotter blev ofret, og histologisk analyse blev udført på kontrolelementet skåret og behandlet lårben. Knogledefekter indeholder kun kollagen svamp resulterede i ikke-union, mens rhBMP-2 behandling givet dannelsen af en periosteal afstumpede og ny knogle remodellering. Dyr genvundet godt efter implantation, og ekstern fiksation lykkedes at stabilisere de femoralis defekter over 12 uger. Denne strømlinet kirurgisk model kunne let anvendes til at studere knogleheling og afprøve nye ortopædisk biomaterialer og regenererende behandlinger in vivo.
Introduction
Ortopædisk traumer kirurgi fokuserer på at behandle en bred vifte af komplekse frakturer. Kritisk diaphyseal segmental knogle defekter har vist sig vanskeligt at behandle klinisk på grund af de omkringliggende muskler og periosteum nedsat regenerative evne samt manglende lokaliseret angiogenese1. Moderne behandlingsteknikker omfatter operativ fiksation med knogle podning, forsinket knoglegraft (Masquelet), knogle transport, fusion eller amputation2,3,4. Hos de fleste patienter, som har Ambulant funktion bevares efter deres traumer, med velfungerende distale lemmer, er lemmer restværdi klart en bedre behandling option5. Disse bjærgning behandlinger kræver ofte iscenesatte kirurgiske indgreb over et længere behandlingsforløb. Nogle forfattere har foreslået, at eksterne fiksering er overlegen i forhold til intern fiksering for disse ansøgninger på grund af nedsat vævsskader under implantation, faldt implanteret overfladeareal, og øget postoperativ indstillingsmuligheder af fiksator6. En prospektiv randomiseret kontrolleret forsøg er imidlertid i øjeblikket undervejs at tydeliggøre denne kontrovers indre versus ekstern fiksering i svær åbne frakturer af tibia7. Desværre, med enten behandling valgt, betydelige komplikation og fiasko satser stadig8,9. Med enten behandlingsmetode, hvad angår segmental knogletab, skal kirurgen slås med segmental diaphyseal defekter, der præsenterer væsentlige udfordringer. Rettelser af segmental defekter skal maksimere knogle stabilisering og samtidig forbedre osteogenic proces10,11.
Den kliniske betydning, men den lavere mængde, kritiske størrelse diaphyseal segmental defekter, er en effektiv, reproducerbare dyremodel nødvendige for, at forskerhold til videre behandlingsteknikker og i sidste ende forbedre kliniske resultater. Forskere har brug at studere i vivo fysiologisk helbredende mekanismer i et pattedyr dyremodel. Mens sådanne modeller af ekstern fiksation allerede findes12,13,14,15, håber vi at kunne give en mere pålidelig metode til ikke-fagforeningerne i ubehandlet dyr, mindske omkostningerne gennem valg af overkommelig fiksator materialer, og skitsere en ligetil kirurgisk protokol for nem anvendelse til fremtidige undersøgelser. Hovedformålet med denne protokol er at etablere en pålidelig og reproducerbar model af en kritisk diaphyseal defekt i rotter. Proceduren blev evalueret ved at vurdere stabilisering og knogle heling i rotte lårben over 12 uger. De sekundære mål inkluderet: at gøre en overkommelig model som en omkostningseffektiv som muligt, forenkling af kirurgisk tilgang og stabilisering og sikring af etisk pasning af dyrene. Forfattere og forskningsgruppe gennemført indledende forsøg med en række forskellige biomaterialer og potentielle regenerative behandlinger til at forbedre healing i denne segmental defekt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lille dyremodeller for ortopædiske skader såsom komplet knoglebrud aktiverer forskning, der udforsker mekanismerne af osteogenesis og vurdering af det terapeutiske potentiale i biomaterialer20. Denne undersøgelse introducerer en rotte segmental defekt model stabiliseret af en brugerdefineret ekstern fiksator, der en lab og Biomedicinsk teknik holdet kan let reproducere for yderligere undersøgelser af bærende osteosynthetic knogle reparation.
Tidligere undersøgelse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af en NIH udstyr Grant 1S10OD023676-01 med ekstra støtte gennem University of Wisconsin afdelinger af ortopædi og rehabilitering og School of Medicine og folkesundhed. Vi vil gerne anerkende UW Carbone kræft Center støtte Grant P30 CA014520 og brug af deres små dyr Imaging facilitet, samt NIH uddannelse Grant 5T35OD011078-08 til støtte af H. Martin. Vi takker også Michael og Mary Sue Shannon for deres støtte til den muskel regenerering partnerskab.
Materials
| 0.9% Sterile Saline | Baxter | 2F7124 | Used for irrigating wound and rehydration |
| 10% Iodine/Povidone | Carefusion | 1215016 | Used to prep skin |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 89370094 | Used as fixative |
| 1mm non-threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1003.15 | Sterilized, used for the most proximal pin |
| 1mm threaded kirschner wire | DePuy Synthes | VW1005.15 | Sterilized, used for the 3 most distal pin slots |
| 2×2 gauze | Covidien | 4006130 | Sterilized, used to prep skin and absorb blood |
| 4-0 Vicryl Suture | Ethicon | 4015304 | Used to close muscle and skin layers |
| 4-40 x 0.25",18-8 stainless steel button head cap screws | Generic | External fixator assembly | |
| 4200 Cordless Driver | Stryker | OR-S-4200 | Used to drill kirschner wires |
| 4×4 gauze | Covidien | 1219158 | Sterilized, used to absorb blood |
| 70 % Ethanol | Used to prep skin | ||
| Baytril | Bayer Healthcare LLC, Animal health division | 312.10010.3 | Added to water as an antibiotic |
| Cefazolin | Hikma Pharmaceuticals | 8917156 | Pre-op antibiotic |
| CleanCap Gaussia Luciferase mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7205 | Modified mRNA encoding for Gaussia Luciferase, keep on ice during use |
| Coelenterazine native | NanoLight Technology | 303 | Substrate for Guassia Luciferase, used to assess luciferase activity in vivo |
| Double antibiotic ointment | Johnson & Johnson consumer Inc | 8975432 | Applied to pin sites post-op as wound care |
| Dual Cut Microblade | Stryker | 5400-003-410 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP120-500 | Used to decalcify bone to prep for histology |
| Extended Release Buprenorphine | ZooPharm | Used as 3 day pain relief | |
| Fenestrated drapes | 3M | 1204025 | Used to establish sterile field |
| Handpiece cord for TPS | Stryker | OR-S-5100-4N | Used to create 5mm defect in femur |
| Heating pad | K&H Pet Products | 121239 | Rat body temperature maintenance |
| Hexagonal head screwdriver | Wiha | 263/1/16 " X 50 | External fixator tightening |
| Induction chamber | Generic | Anesthesia for rats | |
| Infuse collagen sponge with recombinant human Bone Morphogenic Protein-2 | Medtronic | 7510200 | Clinically relevant treatment used as positive control |
| Isoflurane | Clipper | 10250 | Anesthesia for rats |
| IVIS | Perkin Elmer | 124262 | Bioluminescence imaging modality |
| Jig | Custom | Used to place bicortical pins | |
| Lipofectamine MessengerMAX | Fisher Scientific | LMRNA003 | mRNA complexing agent that enables mRNA delivery |
| Sensorcaine-MPF (Bupivicane (0.25%) and Epinephrine (1:200,000)) | APP Pharmaceuticals, LLC | NDC 63323-468-37 | Applied to surgical site for pain relief and vasoconstriction |
| Sterile water | Hospira | 8904653 | Used as solvent for cefazolin powder |
| Titanium external fixator plates | Custom | Prepared in house with scrap titanium and milling machine | |
| Total Performance System (TPS) Console | Stryker | OR-S-5100-1 | Used to create 5mm defect in femur |
| TPS MicroSaggital Saw | Stryker | OR-S-5100-34 | Used to create 5mm defect in femur |
| Ultrafocus Faxitron with DXA | Faxitron | High resolution radiographic imaging modality | |
| Uniprim rat diet | Envigo | TD.06596 | Medicated rat diet |
| Universal Handswitch for TPS | Stryker | OR-S-5100-9 | Used to create 5mm defect in femur |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469 | Skin closure |
Riferimenti
- Filipowska, J., Tomaszewski, K. A., Niedźwiedzki, &. #. 3. 2. 1. ;., Walocha, J. A., Niedźwiedzki, T. The role of vasculature in bone development, regeneration and proper systemic functioning. Angiogenesis. 20 (3), 291-302 (2017).
- Charalambous, C. P., Akimau, P., Wilkes, R. A. Hybrid monolateral-ring fixator for bone transport in post-traumatic femoral segmental defect: A technical note. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 129 (2), 225-226 (2009).
- Xing, J., et al. Establishment of a bilateral femoral large segmental bone defect mouse model potentially applicable to basic research in bone tissue engineering. The Journal of Surgical Research. 192 (2), 454-463 (2014).
- Chadayammuri, V., Hake, M., Mauffrey, C. Innovative strategies for the management of long bone infection: A review of the Masquelet technique. Patient Safety in Surgery. 9 (32), (2015).
- Koettstorfer, J., Hofbauer, M., Wozasek, G. E. Successful limb salvage using the two-staged technique with internal fixation after osteodistraction in an effort to treat large segmental bone defects in the lower extremity. Archives of Orthopaedic and Trauma Surgery. 132 (19), 1399-1405 (2012).
- Fragomen, A. T., Rozbruch, S. R. The mechanics of external fixation. The Musculoskeletal Journal of Hospital for Special Surgery. 3 (1), 13-29 (2007).
- O’Toole, R. V., et al. A prospective randomized trial to assess fixation strategies for severe open tibia fractures: Modern ring external fixators versus internal fixation (FIXIT Study). Journal of Orthopaedic Trauma. 31, S10-S17 (2017).
- Fürmetz, J., et al. Bone transport for limb reconstruction following severe tibial fractures. Orthopedic Reviews. 8 (1), 6384 (2016).
- Dohin, B., Kohler, R. Masquelet’s procedure and bone morphogenetic protein in congenital pseudarthrosis of the tibia in children: A case series and meta-analysis. Journal of Children’s Orthopaedics. 6 (4), 297-306 (2012).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11, 45-54 (2015).
- Pascher, A., et al. Gene delivery to cartilage defects using coagulated bone marrow aspirate. Gene Therapy. 11 (2), 133-141 (2004).
- Glatt, V., Matthys, R. Adjustable stiffness, external fixator for the rat femur osteotomy and segmental bone defect models. Journal of Visualized Experiments. (92), (2014).
- Betz, O. B., et al. Direct percutaneous gene delivery to enhance healing of segmental bone defects. The Journal of Bone and Joint Surgery. 88 (2), 355-365 (2006).
- Fang, J., et al. Stimulation of new bone formation by direct transfer of osteogenic plasmid genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (12), 5753-5758 (1996).
- Kaspar, K., Schell, H., Toben, D., Matziolis, G., Bail, H. J. An easily reproducible and biomechanically standardized model to investigate bone healing in rats, using external fixation. Biomedizinische Technik. 52 (6), 383-390 (2007).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. American Veterinary Medical Association. , (2013).
- McKay, W. F., Peckham, S. M., Badura, J. M. A comprehensive clinical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 (INFUSE Bone Graft). International Orthopaedics. 31 (6), 729-734 (2007).
- . . Living lmage Software. , (2006).
- Bassett, J. H. D., Van Der Spek, A., Gogakos, A., Williams, G. R. Quantitative X-ray imaging of rodent bone by faxitron. Methods in Molecular Biology. , 499-506 (2012).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips, and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Lieberman, J. R., et al. The effect of regional gene therapy with bone morphogenetic protein-2-producing bone-marrow cells on the repair of segmental femoral defects in rats. The Journal of Bone and Joint Surgery. 81 (7), 905-917 (1999).
- Tsuchida, H., Hashimoto, J., Crawford, E., Manske, P., Lou, J. Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats. Journal of Orthopaedic Research. 21 (1), 44-53 (2003).
- Jiang, H., et al. Novel standardized massive bone defect model in rats employing an internal eight-hole stainless steel plate for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2162-2171 (2018).
- Baltzer, A. W., et al. Genetic enhancement of fracture repair: Healing of an experimental segmental defect by adenoviral transfer of the BMP-2 gene. Gene Therapy. 7 (9), 734-739 (2000).
- Li, Y., et al. Bone defect animal models for testing efficacy of bone substitute biomaterials. Journal of Orthopaedic Translation. 3 (3), 95-104 (2015).
