使用基因激活 crispr 过度表达长非编码 rna
Summary
传统的基于 cdna 的过度表达技术由于具有潜在功能的多个拼接形式, 对长非编码 rna 的过度表达的适用性有限。本综述报告了一个协议使用 crispr 技术超细的多个拼接变体的长非编码 rna。
Abstract
长非编码 rna (lncrna) 生物学是一个新的和令人兴奋的研究领域, 自2007年以来, 来自该领域的出版物数量呈指数级增长。这些研究证实, 几乎所有疾病的情况都发生了变化。然而, 由于缺乏蛋白质产品、组织特异性表达、表达水平低、拼接形式复杂、物种之间缺乏保护, 研究环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的环境中的神经网络的功能作用仍然困难。鉴于物种特异性表达, 在研究疾病过程时, 英克拉研究往往仅限于人类的研究背景。由于 ncrna 在分子水平上发挥作用, 因此解剖而不是去除而不是过度表达而不是超表达而不是超表达而不是超表达而不是多表达的。本文提出了一种在体外超表达英 r a 的书面可视化协议。作为一个有代表性的实验, 与炎症性肠病相关的英卡纳, 干扰素伽玛反义 1 (ifng-as1), 在 jurkat t 细胞模型中被证明是过度表达。为了实现这一目标, 激活聚集定期间隔的短回文重复 (crispr) 技术被用来使内源基因组位点过度表达。激活 crispr 技术的目标是一组转录因子到一个基因的转录起始位点, 使多个 incrna 拼接形式的强大过度表达。这一程序将分为三个步骤, 即 (i) 指导 rna (grna) 设计和载体构建, (ii) 病毒生成和转导, (iii) 菌落筛查过度表达。在这一具有代表性的实验中, jurkat t 细胞的 ifng-as1 增强了20倍以上。
Introduction
虽然大多数生物医学研究都集中在蛋白质编码转录记录上, 但大多数转录基因实际上是由非编码 rna (ensembl 发布 93) 组成的。目前的研究开始探索这一领域, 2007年至2017年期间, 关于疾病过程中的 inrna 的出版物数量呈指数级增长1。这些出版物表明, 许多 inrna 与疾病有关。然而, 与 mrna 相比, 这些神经网络的分子机制由于其功能不同而难以研究。使理解信息素的作用的问题更加复杂, 而英特罗 a 的表达水平往往低于编码 rna2。此外, 英特拉 a 的保守程度很低, 这限制了基于人的技术的功能研究3。研究这些新基因机制的一种方法是在培养的细胞中内源过度表达它们。过度表达研究可以提供有关特定基因功能的关键信息, 并使研究人员能够剖析关键的分子途径。
一种激活 lncRNA 基因转录的新方法是基于 gersbach 实验室最初开发的 crispr 技术。该协议已被改编用于英卡纳生物学和这些基因在其他模型系统中的表达。在 crispr 过度表达技术中, 一种名为 crispr 相关蛋白 9 (cas9) 的蛋白质可以通过 cas9 识别的反义 grna 指向 dna 序列。通常情况下, cas9 会诱导 dna 裂解;然而, 以前为过度表达技术开发的 cas9 中的突变会停用这一步骤5。当转录激活剂融合到 “死” cas9 (dcas9) 并转化为细胞系时, 就能实现 ncrna 的内源性过度表达 4,6。添加了对 grna 的额外修饰, 使额外的转录因子与 grna 结合, 提高了 dcas9 基因激活系统的疗效 10倍7倍。重要的是, 它表明, 转录激活需要接近 (和 lt;200 bp) 转录起始位基因, 使一个特定的隆起地区7。与 crispr 淘汰赛技术不同, dcas9 和 grna 盒式磁带需要集成到基因组中, 以允许细胞在多代人的多代中保持过度表达。实现这一目标的一种方法是使用慢病毒集成含有 dcas9 和 grna 的盒式磁带。整合后, 可以确定英克斯拉基因的表达。
在本文中, 将演示一种在 jurkat t 细胞模型中过度表达的协议。一个循序渐进的过程显示, 也可以适应粘附细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
本手稿提出了一种在体外使用激活 crispr 超细的协议。这是研究长期非编码 rna 时的一项特别重要的技术, 因为转录产物是功能单元。在过度表达后, 研究人员可以在研究结合伙伴时使用这些细胞来提高信噪比, 甚至可以测量英 r r a 水平增加对细胞的影响。此外, 由于 incrna 经常作用于顺基因, 这种内源性过度表达技术使这些事件能够被研究 11,12.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
c. p. 由 ro1 dk60729 和 p30 dk 41301-26 提供支持。d. p. 由 crohn & 结肠炎基金会 (ccfa) 职业发展奖、cure: 消化系统疾病研究中心 (ddrc) dk41301 和加州大学洛杉矶分校临床和转化科学研究所 (ctsi) ul1tr881 提供支持。加州大学洛杉矶分校病毒学核心由艾滋病研究中心 (cfar) 资助 5p30 ai028697。ucla 综合分子技术核心得到 cureea/p30 赠款 dk041301 的支持。这项工作也得到了加州大学洛杉矶分校艾滋病研究所的支持。
Materials
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016 | |
| cDNA synthesis kit (iScript) | BioRad | 1708891 | |
| dCas9 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA |
| dCas9 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT |
| dCas9 vector | Addgene | 50918 | |
| DMEM | Corning | 10013CM | |
| Ethanol | Acros Organics | 61509-0010 | |
| FBS | Sigma Aldrich | F2442 | |
| gRNA plasmid | VectorBuilder | VB180119-1195qxv | |
| HEK293T cells | ATCC | CRL-1573 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| HPRT1 forward primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GACCAGTCAACAGGGGACAT |
| HPRT1 reverse primer | Integrated DNA Technologies | n/a | GCTTGCGACCTTGACCATCT |
| Hygromycin B | Corning | MT3024CR | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP2618-500 | |
| Jurkat cells | ATCC | TIB-152 | clone E6-1 |
| L-glutamine | Corning | 25005Cl | |
| LB agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1426-2 | |
| Maxi-prep kit (Plasmid Purification Kit) | Qiagen | 12362 | |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | NIST2186II | |
| Optimem I reduced serum media | Gibco | 31985070 | |
| p24 elisa | Perkin Elmer | NEK050B | |
| PBS | Corning | 21-040-CMR | |
| Penicillin and Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | |
| pMDG2.G | Addgene | #12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | #60488 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma Aldrich | P-4832 | |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003 | |
| pRSV-REV | Addgene | #12253 | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma Aldrich | P8833 | |
| RNA purification kit (Aurum RNA mini) | BioRad | 7326820 | |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | B5887 | |
| SYBR green (iTaq universal) | BioRad | 1725122 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Riferimenti
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