توفير حساسية خلية واحدة، قياس التدفق في الوقت الحقيقي مناسبة فريدة لتحديد وظائف مستقبلات المتعدد الثقافات الحية. باستخدام خلايا السلف العصبية الكبار، تم تقييم وظيفة مستقبلات P2X7 عن طريق تدفق الكالسيوم الكشف عنها بواسطة الكالسيوم مؤشر صبغ، تشكيل المسام transmembrane اثيديوم بروميد امتصاص، واستخدام الخرز مطاط الفلورسنت البلعمه.
خلية يعيش التدفق الخلوي يستخدم متزايد بين علماء الأحياء الخلية للتحديد الكمي للعمليات البيولوجية في العيش خلية ثقافة. هذا البروتوكول وصف أسلوب حيث يتم توسيع خلية يعيش التدفق الخلوي عند تحليل الوظائف المتعددة لتنشيط مستقبلات P2X7 في الوقت الحقيقي. استخدام وحدة نمطية وقت مثبتة على سيتوميتير تدفق، يمكن تقييم وظائف خلية يعيش وتآمروا على مدى فترة زمنية معينة لاستكشاف حركية تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام transmembrane البلعمه. هذا الأسلوب البسيط مفيد كما يمكن تقييم جميع المهام المتعارف عليه ثلاثة من مستقبلات P2X7 باستخدام آلة واحدة، والبيانات المجمعة المرسومة على مر الزمن ويقدم معلومات عن كل خلية يعيش السكان بدلاً من خلية واحدة تسجيلات غالباً الحصول عليها باستخدام أساليب التصحيح-المشبك تحديا من الناحية التقنية. استخدام صبغة مؤشر كالسيوم الكالسيوم تدفق التجارب، في حين تعتمد فحوصات تشكيل المسام P2X7 على اثيديوم بروميد السماح لهم بالمرور عبر ترانسميمبراني المسام المشكلة عند تركيزات عالية مؤثر. الأصفر والأخضر الخرز مطاط (YG) تستخدم لقياس البلعمه. يتم تطبيق يضع محددة والخصوم للتحقيق في آثار نشاط مستقبلات P2X7. كل على حدة، يمكن تعديل هذه الأساليب لتوفير البيانات الكمية على أي عدد من قنوات الكالسيوم ومستقبلات بورينيرجيك والكاسح. أخذت معا، أنها تسلط الضوء على كيفية استخدام الخلوي في الوقت الحقيقي يعيش خلية تدفق طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة، واستنساخه، وقابلة للقياس الكمي للتحقيق في وظيفة مستقبلات P2X7.
دراسة الإشارات بورينيرجيك واسعة النطاق ومتعددة الأوجه، والتي تنطوي على الفيزيولوجيا الخلوية والكيمياء الحيوية، وعلم الأدوية. إشارات بورينيرجيك وتشارك في عدد لا حصر له من العمليات الخلوية والجزيئية، من السرطان، وتنظيم دورة الخلية إلى خلية خلية الاتصالات وبيولوجيا الخلايا الجذعية؛ على هذا النحو، هناك غالباً ما يمكن أن تعدل بورينيرجيك الإشارات لفائدة علاجية. مستقبلات بورينيرجيك، تلقت مستقبلات P2X7 قدر كبير من الاهتمام في السنوات الأخيرة بسبب إمكاناتها كهدف علاجي للعديد من الأوضاع الملتهبة1. تطورت أساليب لدراسة المستقبلات وتم تكييفها على مر السنوات لتسهيل هذا البحث2،3،،من45. هنا، يمكننا وصف أسلوب تدفق الخلية يعيش الخلوي للتحقيق في مهام متعددة من مستقبلات P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار المستمدة من منطقة سوبفينتريكولار (SVZ) والمغزلي المسنن هيبوكامبال.
ووصفت مستقبلات P2X7 أولاً مستقبلات P2Z، أو مستقبلات ‘موت الخلية’، التنشيط مع تركيزات عالية من النتائج الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) في تشكيل المسام transmembrane كبيرة إنفاذا للجزيئات تصل إلى 900 دا6. وهذا يؤدي إلى إعادة ترتيب سيتوسكيليتال، تشكيل المسام transmembrane، وربما المبرمج و/أو نخر7. تقليديا، هو كمية هذه الدالة P2X7 بامتصاص الأصباغ كبيرة الوزن الجزيئي مثل يو-برو-1 أو اثيديوم بروميد، الذي فلوريس عندما أولمبية صيفية مع الحمض النووي3،8. لوحة القارئ الأساليب، وهي سريعة والسماح لرفع مستوى، عموما لا تسمح بمراقبة حركية. الأسلوب الموصوفة هنا يستند على امتصاص اثيديوم ويسمح زيادة الأسفار يحتفل بمرور الوقت، توفير مزيد من عمق للمعلومات فيما يتعلق بالسرعة لتشكيل المسام. مستقبلات P2X7 أظهرت منذ ذلك الحين تيسير عدد من الوظائف نونيموني، مع ردود متميزة اعتماداً على التعرض الوقت ومؤثر تركيز9،10. موجز التنشيط بتركيزات أقل من النتائج ATP في تدفق الأيونات الموجبة لأغراض توصيل العصبي وإشارة11. استخدام التدفق الخلوي لقياس تدفق الكالسيوم ويتغلب على المشاكل المرتبطة بأساليب معقدة وصعبة من الناحية الفنية – وخاصة التصحيح لقط لقياس التيارات إلى الداخل التي لا تقدر بثمن من التفاصيل فيما يتعلق بالتغيير في إمكانات عبر تقديم غشاء الخلية ولكن لا تسمح للسكان تحليل2. الوظيفة الثالثة لمستقبلات P2X7 يحدث في غياب ATP، حيث أثبتت مستقبلات P2X7 لتسهيل البلعمه في جهاز المناعة والجهاز العصبي9،،من1213. التطورات في تقنيات الفحص المجهري سمحت التصور من ترتيبات جديدة سيتوسكيليتال أثناء عملية الامتصاص، على الرغم من أن التحليل الكمي والسكان يمكن أن لا يزال يمثل تحديا.
خلية يعيش تدفق الخلوي طريقة مفصلة هنا يسمح للتحقيق في جميع الوظائف الرئيسية الثلاث لمستقبلات P2X7 في الوقت الحقيقي. يسمح بإدراج جهاز وحدة الوقت على سيتوميتير تدفق التحكم في درجة الحرارة والتحريك المستمر للخلايا في التعليق. يمكن تسليم المحفزات مؤثر وخصم داخل ثانية، مما يسمح بقياس الاستجابة الخلوية دون انقطاع القريب. وهذا يمثل طريقة سريعة وبسيطة لتكاثر قياس الدالة مع تجنب استخدام العديد من أنظمة التحليل. من المهم أن نلاحظ أن هذا البروتوكول قد تكييفها بسهولة لتناسب أي نوع من الخلايا، ويمكن أن تستخدم لفحص أنواع فرعية مستقبلات أخرى نظراً لإدراج يضع محددة أو مثبطات، اعتماداً على خصائصها.
وتعرض هذه الورقة على بروتوكول مفصل لتحليل وظيفة مستقبلات P2X7 في الثقافات الخلية العصبية السلف المستمدة من منافذ العصبية الكبار. التطبيقات المحتملة للكبار من السلف العصبية الخلايا مجموعة من البحوث لأغراض علاجية، وذلك يجب أن يكون أسلوب ثقافة قوية واستنساخه. وهناك عدد من الجوانب الرئيسية لهذا البروتوكول، قد تؤثر على نوعية الثقافة نقطة النهاية. بمجرد إزالة من الجمجمة، الدماغ لا ينبغي أن تجف وينبغي أن يقوم التشريح بأقصى سرعة ممكنة. لا سيما مع الحصين، سيؤدي إلى الرعاية الإضافية المتخذة لإزالة أي الأوعية الدموية أو الأنسجة الغشائية في غلة خلية السلف متفوقة. عملية الانفصال وتريتوريشن يمكن أن تؤثر بشكل كبير في عدد المجالات التي تم الحصول عليها في ثقافة؛ التحريض الأنسجة خلال الاحتضان مع التربسين يدتا سيؤدي إلى حل أكثر تجانساً. استخدام زجاج مصقول النار المراعي ماصة أكثر P1000 ماصة بلاستيكية نصيحة ينصح بشدة للحد من موت الخلايا وتحسين الثقافة الناتجة عن ذلك. تجنب أوفيرتريتوراتينج. رغم هذه الاحتياطات، الإجراء يمكن إنشاء الكثير من الحطام في ثقافة P0، وتجنب فقدان الخلايا السلف أو الغسيل أو تغذية الثقافة ينبغي تجنب حتى شكلت مجالات.
عدد من الاختلافات بين هيبوكامبال والثقافات سفز سوف يكون واضحا في P0. الثقافات هيبوكامبال تسفر عن عدد أقل من المجالات، وهذه عموما الالتزام. استخدام تلميح ماصة لرفع بلطف من المجالات لمرور الأولية. ولوحظت مجالات ملتصقة لا في الفقرات اللاحقة. ماركات مختلفة من قوارير زراعة الأنسجة قد يتسبب في المجالات، مجالات هيبوكامبال خاصة، الالتزام وتنمو كمستعمرات في الجزء السفلي من الطبق. وهذا لم يتم العثور على تغيير أي النتائج النهائية لهذا البروتوكول ولكن ينبغي رصد، وينبغي الحفاظ على الاتساق حيثما كان ذلك ممكناً.
الطرق السابقة المستخدمة لقياس وظيفة مستقبلات P2X7، مثل تصحيح لقط لتسجيل تدفق الكالسيوم، هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وربما لا تقدم سوى معلومات في خلية واحدة. ويقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة واستنساخه لتحليل جميع الوظائف الرئيسية الثلاث لمستقبلات P2X7 باستخدام جهاز واحد. الخلوي حل الوقت تدفق الخلية يعيش يسمح بتحليل جميع السكان ويوفر الباحث بمعلومات تتعلق بحركية تدفق الكالسيوم وتشكيل المسام، و/أو الدالة متجولة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التدفق الخلوي بسهولة كطريقة لتقييم أنماط التعبير علامة والتحليل السكاني استناداً إلى مستويات التعبير الحجم أو البروتين في الخلية.
وعند إجراء هذه التجارب، يمكن ملاحظة الاختلافات في تدفق الكالسيوم القصوى أو امتصاص اثيديوم معدلات البلعمه بين تكرار. لتقليل هذا، حجم المجال، شروط الثقافة، وتغذية النظام يجب أن يكون متسقا صحة الخلايا سيكون لها تأثير كبير على النتائج التي تم الحصول عليها. الوقت على الجليد يمكن أن تؤثر أيضا البيانات، حتى تكفل كل شيء أعد قبل الوقت المحدد حتى لا يكون الحد الأدنى الوقت على الجليد. ضمان اتساق صبغ مؤشر الكالسيوم وقت التحميل. وثمة عامل آخر يمكن أن تؤدي إلى تناقضات كبيرة في التسجيلات الكالسيوم القصوى هو التباين بين دفعات ATP. إعداد الأرصدة ATP بالغ الأهمية، وينبغي تجنب استخدام دفعات مختلفة للتجارب نفسها. ويوصي أيضا مقارنة الدفعات القديمة والجديدة للتأكد من ATP متسقة. كما يمكن فعالية الخصوم P2X7 خط الخلية وتعتمد دفعة، لذلك قد يكون الأمثل لأوقات الاحتضان والتركيزات المطلوبة.
تجدر الإشارة إلى أن التدفق الكالسيوم/افلوكس هي واحدة من المهام الأساسية وأكثرها تعقيداً الخلوية ويمكن أن يكون توسط العديد من مستقبلات. تدفق الكالسيوم المستحثة ATP، كقياس كلاسيكية لوظيفة قناة/المسام P2X7، قد لا تعكس بدقة وظيفة حقيقية من مستقبلات P2X7، ك ATP أيضا تنشيط مستقبلات P2Y لإطلاق سراح الكالسيوم داخل الخلايا. وفي هذه الحالة، قد تكون الباريوم الأيونات الموجبة أفضل لاستخدام بدلاً من الكالسيوم كما هو في التدفق أحادي الاتجاه16. للتمييز بين المساهمة من مستقبلات P2Y في تدفق الكالسيوم، يمكن استخدام الظروف حيث يتم إضافة يدتا 1 ملم أو جليكول-bis(β-aminoethyl ether)-N، N، N′، حمض N′-tetraacetic (عطا) إلى المتوسطة ك+ بدلاً من كاكل2 في هذا المقايسة.
هذا البروتوكول يمكن أيضا بسهولة تكييفها لتناسب أنواع الخلايا الأخرى، ويمكن أن تكون مفيدة للتحقيق في وظيفة مستقبلات قناة أيون بديلة أو المستقبلات التي تشارك في البلعمه. هذا الأسلوب أيضا يمكن أن تتكيف مع جهاز تدفق الخلوي دون وحدة نمطية وقت. على سبيل مثال، قد يتم تنفيذ فحوصات البلعمه حيث يتم إضافة الخرز YG 7-8 دقيقة قبل التحليل بقياس التدفق التقليدي. تبقى الخلايا عند 37 درجة مئوية ودوامه مستمرة لهم. وهذا لن يوفر المعلومات في الوقت الحقيقي ولكن الاختلافات في الأسفار النهائي يعني ستبلغ ما زال الباحث فيما يتعلق بالأداء الوظيفي لمستقبلات P2X7.
الفائدة في مستقبلات P2X7 مخدرات تستهدف21،22 أو حتى بتوجيه عملية تسليم المخدرات23،24 يتزايد بسرعة، ولذا يجب أن تكون أساليب لدراسة هذا مستقبلات ملغز باستمرار تكييفها وتحسينها إلى تسهل هذه الدراسات. هذا البروتوكول يحدد المنهجيات التي يمكن استخدامها لاستكشاف الدالة P2X7 في خلايا السلف العصبية الكبار، ومن المأمول أن تحقيق فهم أكبر لمستقبلات P2X7 في منافذ العصبية قد تؤدي إلى إحراز تقدم في علاج السكتة الدماغية و الإصابات الدماغية الأخرى.
The authors have nothing to disclose.
المؤلف يود أن يشكر ماريا قصرمان وشين هوانغ لمساهماتها في هذا البحث. بتأييد هذا العمل بمنح من “ريبيكا ل. كوبر مؤسسة البحوث الطبية” M.W.، T.C.L.، وحركة التحرير، وإلى T.C.L. من “الوطنية للصحة” ومجلس البحوث الطبية (NHMRC) من أستراليا (571100 و 1048082) و (مؤسسة خيرية باكستر سيدني، أستراليا). جي أيده الزمالة مستقبل مجلس البحوث الأسترالية (ARC) (FT120100581)، وتمويل مشروع المنح (1048082 و 1061419 و 1120095) والتشغيلية منحة الحكومة الفيكتوري دعم البنية التحتية للمعهد فلوري. وأيد حركة التحرير تشارلز دال كيلمان، دكتوراه في الطب ما بعد الدكتوراه مكافأة (2010) من الدولي الشبكية بحوث مؤسسة (الولايات المتحدة الأمريكية).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |