Giver én celle følsomhed, er real-time flowcytometri unikt tilpasset til at kvantificere multimodale receptor funktioner af levende kulturer. Ved hjælp af voksne neurale stamceller, blev P2X7 receptor funktionen vurderet via calcium tilstrømning registreres af calcium indikator farvestof, transmembrane pore dannelsen af ethidium bromid optagelse og fagocytose ved hjælp af fluorescerende latex perler.
Live-celle flowcytometri bruges i stigende grad blandt celle biologer for at kvantificere biologiske processer i en levende celle kultur. Denne protokol beskriver en metode, hvorved live-celle flowcytometri er udvidet ved for at analysere den mangfoldig funktioner af P2X7 receptor aktivering i realtid. Ved hjælp af en tid modul installeret på en flow forskellige kan live-celle funktionalitet vurderes og afbildet i en given periode at udforske kinetik af calcium tilstrømning, transmembrane pore dannelse og fagocytose. Denne simple metode er fordelagtig, da alle tre kanoniske funktioner af P2X7 receptoren kan vurderes ved hjælp af én maskine, og de indsamlede data afbildes over tid giver oplysninger på hele live-celle population i stedet for én celle optagelser ofte fremstillet ved hjælp af teknisk udfordrende patch-clamp metoder. Calcium tilstrømning eksperimenter bruger en calcium indikator farvestof, mens P2X7 pore dannelse assays afhængige ethidiumbromid får lov til at passere gennem den transmembrane pore dannet ved høj agonist koncentrationer. Gul-grøn (YG) latex perler er udnyttet til at måle fagocytose. Specifikke agonister og antagonister anvendes til at undersøge virkningerne af P2X7 receptor aktivitet. Disse metoder kan individuelt, ændres for at tilvejebringe kvantitative data på et vilkårligt antal calcium kanaler og purinergic og skyllevæske receptorer. Taget sammen, fremhæver de, hvordan brugen af real-time live-celle flowcytometri er en hurtig, omkostningseffektiv, reproducerbare og kvantificerbare metode til at undersøge P2X7 receptor funktion.
Studiet af purinergic signalering er bred og mangesidet, der involverer cellulær fysiologi, biokemi og farmakologi. Purinergic signalering er involveret i en uendelig række af cellulære og molekylære processer, fra kræft og celle cyklus regulering til celle-celle kommunikation og stamceller biologi; som sådan, findes der ofte et potentiale til at modulere purinergic signalering for en terapeutisk effekt. Purinergic-receptorer, har P2X7 receptor modtaget betydelig opmærksomhed i de seneste år på grund af sit potentiale som en terapeutisk destination for mange inflammatoriske tilstande1. Metoder til at studere receptoren har udviklet sig og blevet tilpasset årenes løb for at lette denne forskning2,3,4,5. Her, beskriver vi en live-celle flow flowcytometri metode til at undersøge den mangfoldig funktioner af P2X7 receptorer i voksne neurale stamceller afledt fra den subventricular zone (SVZ) og den hippocampus dentate gyrus.
P2X7 receptoren blev første gang beskrevet som P2Z receptoren, eller ‘celledød’ receptor, som dens aktivering med høje koncentrationer af adenosin trifosfat (ATP) resulterer i dannelsen af en stor transmembrane pore gennemtrængelig for molekyler op til 900 Da6. Dette fører til cytoskeletal omlejring, transmembrane pore dannelse og potentielt, apoptose og/eller nekrose7. Traditionelt, er denne funktion i P2X7 kvantificeret ved optagelsen af store molekylvægt farvestoffer såsom YO-PRO-1 eller ethidium methylbromid, der fluorescerer når imidlerid med DNA3,8. Plade læser metoder, som er hurtig og lader upscaling, generelt tillader ikke for observation af kinetik. Metoden beskrevet her er baseret på ethidium udbredelse og tillader fluorescens stigning skal følges over tid, giver en større dybde af oplysninger med hensyn til hastigheden af pore dannelse. P2X7 receptorer har siden vist sig at fremme en række nonimmune funktioner, med forskellige svar alt efter eksponering tid og agonist koncentration9,10. Kort aktivering af lavere koncentrationer af ATP resultater i kation tilstrømningen til formål af neurotransmitter og signal transduktion11. Ved hjælp af flowcytometri for at måle calcium tilstrømning overvinder problemerne med besværlige og teknisk udfordrende metoder — især patch fastspænding for at måle indad strømninger, som give uvurderlige oplysninger om ændringen i potentiale på tværs af en cellemembran, men tillader ikke for befolkningen analyse2. Den tredje funktion af P2X7 receptorer opstår i mangel af ATP, hvor P2X7 receptorer er blevet påvist for at lette fagocytose i både immunforsvaret og nervesystemet9,12,13. Fremskridt i mikroskopi-teknikker har tilladt visualisering af cytoskeletal rearrangementer under optagelsen processen, selvom kvantificering og befolkningen analyse kan stadig udgør en udfordring.
Metoden live-celle flow flowcytometri detaljeret her giver mulighed for undersøgelse af alle tre hovedfunktioner P2X7 receptorer i realtid. Medtagelsen af en tid modul enhed på flow forskellige tillader temperaturkontrol og løbende omrøring af celler i suspension. Agonist og antagonist stimuli kan leveres inden for et sekund, så i nærheden af uafbrudt måling af den cellulære reaktion. Dette giver en hurtig og enkel metode til reproducerbar kvantificere funktion samtidig undgå brugen af flere assay systemer. Det er vigtigt at bemærke, at denne protokol kan nemt tilpasses passer til enhver celletype og kunne bruges til at undersøge andre receptor subtype givet medtagelsen af specifikke agonister eller hæmmere, alt efter deres egenskaber.
Dette paper præsenterer en detaljeret protokol til analyse af P2X7 receptor funktion i neurale stamfader cellekulturer stammer fra de voksne neurogen nicher. De potentielle anvendelser for voksne neurale stamceller celler spænder fra forskning til behandlingsformål, og så metoden for kultur skal være robust og reproducerbar. Der er en række vigtige aspekter til denne protokol, der kan påvirke kvaliteten af slutpunkt kultur. Når fjernet fra kraniet, hjernen må ikke tørre og dissektion bør udføres så hurtigt som muligt. Især med hippocampus medfører ekstra omhu at fjerne enhver blodkar eller hindeagtig væv superior stamfader celle udbytter. Dissociation og ændring processen kan stærkt påvirke antallet af kugler fremstillet i en kultur; agiterer vævet under inkubation med trypsin-EDTA vil resultere i en mere homogen opløsning. Brugen af en brand-poleret glas græs pipette over en P1000 plast pipette tip er stærkt anbefales at reducere celledød og forbedre den resulterende kultur. Undgå overtriturating. På trods af disse forholdsregler, at proceduren kan oprette en masse snavs i P0 kultur og for at undgå at miste stamceller, vask eller fodring kultur bør undgås indtil kugler har dannet.
En række forskelle mellem den hippocampus og SVZ kulturer vil være indlysende på P0. Hippocampus kulturer give færre områder, og disse generelt overholder. Bruge en pipette tip til forsigtigt løfte områderne for den første passage. Vedhængende kugler blev ikke observeret i efterfølgende passager. Forskellige mærker af vævskultur flasker kan forårsage sfærer, især hippocampus sfærer, at overholde og vokse som kolonier i bunden af fadet. Dette blev ikke fundet for at ændre enhver downstream resultater for denne protokol, men bør overvåges, og ensartethed kan opretholdes, hvor det er muligt.
Tidligere metoder, der anvendes til at måle P2X7 receptor funktion som patch fastspænding for at optage calcium tilstrømning, er tidskrævende og besværlig og kan kun give oplysninger om en enkelt celle. Denne protokol udgør en hurtig og reproducerbar metode til at analysere alle tre hovedfunktioner P2X7 receptorer ved hjælp af én maskine. Tidsopløst live-celle flowcytometri giver mulighed for hele befolkningen analyse og giver forskeren med oplysninger om kinetik af calcium tilstrømning, pore dannelse og/eller fagocyterende funktion. Ud over dette, kan flowcytometri nemt bruges som en metode til vurdering af markør udtryk mønstre og befolkningen analyse baseret på celle størrelse eller protein udtryk niveauer.
Når der udføres disse eksperimenter, kan forskelle i maksimal calcium tilstrømning, ethidium optagelse eller fagocytose satser iagttages mellem gentagelser. For at minimere dette, kugle-størrelse, skal dyrkningsbetingelserne og fodring regime konsekvent som sundheden for cellerne vil have en betydelig indvirkning på de opnåede resultater. Tid på is kan også påvirke dataene, så sikre, at alt er forberedt i god tid så der minimal tid på isen. Sikre, at calcium indikator farvestof loading tid er konsekvent. En anden faktor, der kan føre til store uoverensstemmelser i maksimal calcium optagelser er variation mellem ATP partier. Forberedelse af ATP bestande er afgørende, og brugen af forskellige partier til de samme forsøg bør undgås. Sammenligning af gamle og nye partier for at sikre ATP er konsekvent anbefales også. Effektiviteten af P2X7 antagonister kan også være celle-linje – og batch-afhængige, så optimering af inkuberingstider og koncentrationer kan være påkrævet.
Det er værd at bemærke, at calcium tilstrømning/udstrømning er en af de mest grundlæggende og komplekse cellulære funktioner og kan være medieret af mange receptorer. ATP-induceret calcium tilstrømning, som en klassisk måling for P2X7 kanal/pore funktion, ikke muligvis præcist afspejler den sande funktion af P2X7 receptorer, som ATP kan også aktivere P2Y receptorer at frigive intracellulære calcium. I dette tilfælde kan barium være en bedre kation at bruge i stedet for calcium som sin tilstrømning er envejs16. For at differentiere bidrag fra P2Y receptorer i calcium tilstrømning, kan betingelser hvor 1 mM EDTA eller ethylenglycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N′, N′-tetraacetic syre (EGTA) er føjet til K+ medium i stedet for CaCl2 anvendes i dette assay.
Denne protokol kan også let tilpasses for at passe til andre celletyper og kan være nyttige for at undersøge funktionaliteten af alternative ion-kanal receptorer eller receptorer, der deltager i fagocytose. Denne metode kan også tilpasses til en flow flowcytometri maskine uden en gang modul. Som et eksempel, kan fagocytose assays udføres hvor YG perler er tilføjet 7-8 min. før analysen af konventionelle flowcytometri. Holde cellerne ved 37 ° C og konstant swirl dem. Dette vil ikke give real-time information, men forskelle i den gennemsnitlige endelige fluorescens informerer stadig forsker om funktionaliteten af P2X7 receptorer.
Interesse i P2X7 receptorer som en drug target21,22 eller selv som en medicinafgivelse rute23,24 vokser hurtigt, og så metoder til at studere denne gådefulde receptor skal løbende tilpasses og forbedres til lette disse undersøgelser. Denne protokol beskriver metoder, der kan bruges til at udforske P2X7 funktion i voksne neurale stamceller, og det er håbet at opnå en større forståelse for P2X7 receptorer i de neurogen nicher kan føre til fremskridt i behandling af apopleksi og andre iskæmiske skader.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Maria Kasherman og Xin Huang for deres bidrag til denne forskning. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation M.W., T.C.L. og M.L. og T.C.L. fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) i Australien (571100 og 1048082) og Baxter velgørenhedsfond ( Sydney, Australien). B.G. blev støttet af den australske Research Council (ARC) fremtid Fellowship (FT120100581), NHMRC projektstøtte (1048082, 1061419 og 1120095) og Victorias regering operationelle infrastruktur støtte Grant Florey Institute. M.L. blev støttet af en Charles D. Kelman, MD postdoc Award (2010) fra internationale Retinal Research Foundation (USA).
A438079 | Tocris | 2972/10 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
AZ10606120 | Tocris | 3323/10 | |
bzATP | Sigma-Aldrich | B6396 | |
cytochalasin D | Sigma-Aldrich | C8273 | |
FACSCalibur | Becton Dickinson | ||
Fluo-8AM | AAT-Bioquest | 21080 | Fluo-4AM and Fura-Red AM have also been used successfully |
Fluoresbrite YG Microspheres | Polysciences Inc | 17154-10 | 1.00 µm, yellow-green |
Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | 200 mM |
HBSS | ThermoFisher Scientific | 14170112 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NeuroCult Basal Medium | Stemcell Technologies | 5700 | Mouse and rat |
NeuroCult Proliferation Supplement | Stemcell Technologies | 5701 | Mouse and rat |
oxidized ATP | Sigma-Aldrich | A6779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | pluronic acid |
Recombinant Murine EGF | Peprotech | 315-09 | |
Recombinant Murine FGF-basic | Peprotech | 450-33 | |
tetramethylammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | T7505 | |
Time Zero Module | Cytek Biosciences | ||
Tissue culture flasks | BD Falcon (Corning) | 353108 (T25), 353136 (T75) | Blue vented screw cap |
TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | with phenol red |
UltraPure Ethidium Bromide | ThermoFisher Scientific | 15585011 | 10 mg/mL |