טיהור והשתלות של תאים ובתאים Myogenic נגזר Exosomes כדי לשפר את תפקוד הלב בעכברים Dystrophic שרירים דושן
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור תפקוד הלב בעכברים ניוון שרירים דושן transiently על ידי משתילים exosomes נגזר נורמליים ובתאים myogenic.
Abstract
אצ’יל דושה ניוון שרירים (DMD) היא X-linked רצסיבי גנטי מחלה נגרמת על ידי חוסר חלבון הדיסטרופין פונקציונלי. לא ניתן לרפא את המחלה, כאשר המחלה מתקדמת, החולה מפתחת תסמינים של קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעה בקצב הלב, אי ספיקת לב מוגדש. עכברים מוטנטים DMDMDX שאינם מבטאים הדיסטרופין, משמשות כמודל העכבר של DMD. במחקר האחרון שלנו, הבחנו כי הזרקת intramyocardial מסוג רחב (WT)-קדמון myogenic נגזר תאים exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר את הביטוי של הדיסטרופין בשריר של עכברים מוטנטים DMDMDX , אשר היה קשור עם שיפור ארעי בתפקוד הלב רומז WT-MPC-Exo עשוי לספק אפשרות להקל על התופעות לב DMD. מאמר זה מתאר את הטכניקה של MPC-Exo טיהור והשתלות לתוך הלב של עכברים מוטנטים DMDMDX .
Introduction
ניוון שרירים דושן (DMD) היא X-linked רצסיבי, מתקדמת neuromuscular מחלה הנגרמת על ידי מוטציה בגן DMD ג’ין ואובדן של הדיסטרופין פונקציונלי1. הדיסטרופין מתבטא בעיקר ביכולת שרירי השלד שריר הלב, מתבטאת פחות2,של השריר החלק, בלוטות אנדוקריניות, נוירונים-3. DMD הוא הסוג הנפוץ ביותר של ניוון עם שכיחות של אחד לכל 3,500 ל 5,000 בחורים היילוד ברחבי העולם4,5. אנשים בדרך כלל לפתח שרירים מתקדמת נמק, אובדן של הליכה עצמאית על ידי בגיל ההתבגרות המוקדם, ומוות בעשורים השני כדי השלישי של חייהם עקב אי ספיקת לב, כשל נשימתי6.
קרדיומיופתיה מורחבת, הפרעות קצב, אי ספיקת לב מוגדש הם נפוצים גילויי DMD7,8לב וכלי דם. לא ניתן לרפא את המחלה, טיפול תומך עשוי לשפר את הסימפטומים או לעכב את ההתקדמות של אי ספיקת לב, אבל זה מאוד קשה לשפר את הלב תפקוד9,10.
דומה לחולים DMD, X-linked ניוון שרירים (MDX) עכברים בחוסר חלבון הדיסטרופין ותסמינים הנוכחי של קרדיומיופתיה11, ולכן נמצאים בשימוש נרחב במחקר קרדיומיופתיה DMD הקשורים. כדי לשחזר הדיסטרופין השרירים מושפע, טיפול בתאי גזע allogeneic הוכיחה להיות טיפול יעיל עבור DMD12,13,14. Exosomes, 30-150 nm קרום שלפוחית מופרש על ידי סוגי תאים שונים, לשחק תפקיד מפתח בתקשורת לתא דרך התחבורה גשמי גנטי, כגון RNA שליח (mRNA) ללא קידוד RNAs15,16,17 ,18,19,20,21.
שלנו מחקרים קודמים הראו כי exosomes נגזר ובתאים myogenic (MPC), כגון C2C12 תא קו, באפשרותך להעביר הדיסטרופין mRNA כדי cardiomyocytes המארח לאחר הזרקה ישירה לב22, המציין כי מסירת allogeneic MPC, נגזר exosomes (MPC-Exo) transiently לשחזר DMD ביטוי גנים בעכברים MDX. מאמר זה מתמקד MPC-Exo טכניקות טיהור והשתלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה של בידוד exosomes טהור חיוני ללמוד את הפונקציה של exosomes. אחת הטכניקות הנפוצות לבידוד exosome היא glycols פוליאתילן (יתדות) מתווכת משקעים17,18,25. Exosomes יכול להיות זירז, יתדות, מגורען על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה. טיהור בתיווך פג הוא נוח מאוד, בעלות …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
טאנג נתמכו באופן חלקי על ידי איגוד הלב האמריקני: GRNT31430008, NIH-AR070029, NIH-HL086555, NIH-HL134354.
Materials
| 0.22-μm Filter | Fisherbrand | 09-720-004 | |
| 15-cm Cell Culture Dish | Thermo Fisher Scientific | 157150 | |
| 24-gauge catheter | TERUMO | SR-OX2419CA | |
| 31-gauge insulin needle | BD | 328291 | |
| 4% paraformaldehyde | Affymetrix | AAJ19943K2 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| 6-0 suture | Pro Advantage by NDC | P420697 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Corning | 30-004-CI | |
| Anti-Dystrophin antibody | Abcam | ab15277 | |
| Antigen retriever | Aptum Biologics | R2100-US | Antigen recovery |
| Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 | |
| C2C12 cell line | ATCC | CRL-1772 | |
| Centrifuge | Unico | C8606 | |
| Change-A-Tip High Temp Cauteries | Bovie Medical Corporation | HIT | |
| Confocal microscopy | Zeiss | Zeiss 780 Upright Confocal | |
| DBA/2J-mdx mice | The Jackson Laboratory | 013141 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CM | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-011-CV | |
| Goat serum | MP Biomedicals, LLC | 191356 | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Ketamine | Henry Schein | 056344 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Mouse Retractor Set | Kent Scientific | SURGI-5001 | |
| Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Rodent ventilator | Harvard Apparatus | 55-7066 | |
| SW-28 Ti rotor | Beckman | 342207 | |
| The Vevo 2100 Imaging Platform | FUJIFILM VisualSonics | Vevo 2100 | Ultrasound System |
| Ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344058 | |
| Xylazine (XylaMed) | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 1XYL003 8XYL006 |
Riferimenti
- Yiu, E. M., Kornberg, A. J. Duchenne muscular dystrophy. Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).
- Nudel, U., et al. Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain. Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).
- Rae, M. G., O’Malley, D. Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).
- Mah, J. K., et al. A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).
- D’Amario, D., et al. A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy. Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).
- Koeks, Z., et al. Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database. Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).
- Kamdar, F., Garry, D. J. Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy. Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).
- Wang, Z., et al. Regenerative Therapy for Cardiomyopathies. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics. Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).
- Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction. Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).
- Quinlan, J. G., et al. Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings. Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).
- Siemionow, M., et al. Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).
- Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies. Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).
- Zhang, Y., et al. Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice. Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).
- Ju, C., et al. Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium. Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).
- Ruan, X. F., et al. Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases. Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).
- Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases. Stem Cells International. 2016, 2417268 (2016).
- Murphy, C., et al. Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases. Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).
- Su, X., et al. Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice. Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).
- Hu, G., et al. Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction. Cell Death & Disease. 3, 381 (2012).
- Bayoumi, A. S., et al. A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).
- Wang, Y., et al. Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).
- Cheruvanky, A., et al. Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).
- Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. Magnetic bead-based isolation of exosomes. Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).
- Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads. Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).
- Teng, X., et al. Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation. Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).
- Aminzadeh, M. A., et al. Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy. Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).
