Identificare gli amminoacidi sovraproduttori utilizzando marcatori rari-codoni-ricchi

Sommario

Questo studio presenta una strategia alternativa al metodo tradizionale basato sull'analogico tossico nell'identificazione di sovraproduttori di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni per ottenere contemporaneamente precisione, sensibilità e alta produttività.

Abstract

Per soddisfare il mercato in continua crescita per gli amminoacidi, sono necessari ceppi di produzione ad alte prestazioni. I prodotti non amnopesonoari sono convenzionalmente identificati sfruttando i concorsi tra gli amminoacidi e i loro analoghi. Tuttavia, questo metodo basato su analogico è di bassa precisione e gli analoghi appropriati per gli amminoacidi specifici sono limitati. Qui, presentiamo una strategia alternativa che consente uno screening accurato, sensibile e ad alta velocità di produzione di amminoacidi utilizzando marcatori rari ricchi di codoni. Questa strategia è ispirata al fenomeno della distorsione dell'uso del codone nella traduzione delle proteine, per la quale i codoni sono classificati in comuni o rari in base alle loro frequenze di occorrenza nel DNA codificante. La traduzione di codoni rari dipende dai corrispondenti RNA di trasferimento rari (tRNA), che non possono essere completamente addebitati dagli amminoacidi cognati in condizioni di fame. Teoricamente, i tRNA rari possono essere addebitati se c'è un surplus di aminoacidi dopo aver caricato i sinonimi isoacceptors comuni. Pertanto, le traduzioni ritardate causate da codoni rari potrebbero essere ripristinate alimentando o sovrapproduzione intracellulari degli amminoacidi corrispondenti. In base a questa ipotesi, viene istituito un sistema di selezione o screening per l'identificazione dei sovraproduttori di amminoacidi sostituendo i codoni comuni degli amminoacidi mirati con le loro alternative rare sinonimi nei geni di resistenza agli antibiotici o nei geni codificare proteine fluorescenti o cromogene. Dimostriamo che le espressioni proteiche possono essere notevolmente ostacolate dall'incorporazione di codoni rari e che i livelli di proteine sono correlati positivamente con le concentrazioni di amminoacidi. Utilizzando questo sistema, gli sovraproduttori di aminoacidi multipli possono essere facilmente esaminati dalle librerie di mutazioni. Questa strategia basata su codone rara richiede solo un singolo gene modificato, e l'ospite è meno probabile che sfuggirà alla selezione rispetto ad altri metodi. Offre un approccio alternativo per ottenere i non amminoacidi sovraproduttori.

Introduzione

L'attuale produzione di amminoacidi dipende fortemente dalla fermentazione. Tuttavia, i titoli e le rese per la maggior parte dei ceppi di produzione di amminoacidi sono al di sotto delle crescenti richieste del mercato globale degli amminoacidi che vale miliardi di dollari^1,2. Ottenere prodotti aminoacidi ad alte prestazioni sono fondamentali per l'aggiornamento dell'industria degli amminoacidi.

La strategia tradizionale per identificare i sovraproduttori di amminoacidi sfrutta i concorsi tra aminoacidi e i loro analoghi nella sintesi proteica^3,

Protocollo

1. Costruzione dei plasmidi che esprimono i geni marcatori rari-codoni-ricchi

1. Selezionare un gene marcatore contenente un numero appropriato di codoni comuni per l'amminoacido mirato.
   NOTA: Per L-leucine, il gene di resistenza alla kanamicina kan^R, che contiene 29 codoni di leucina, di cui 27 sono codoni comuni, viene utilizzato per la costruzione del sistema di selezione¹³. Il gene gfp, che contiene 17 codoni comuni su 19 codoni leule, o il gene di codifica delle proteine viola prancerpurple (ppg), che ospita 14 codoni comuni di leucina, viene utilizzato per il sistema di screening (<....

Risultati

Per il sistema di selezione, si osserva una forte diminuzione dell'OD₆₀₀ per i ceppi che ospitano il gene di resistenza agli antibiotici, ricco di codoni rari, rispetto al ceppo che ospita il gene di resistenza agli antibiotici di tipo selvatico quando viene coltivato in un medio(Figura 1a). Nelle stesse condizioni, la diminuzione della cellula OD₆₀₀ diventa più evidente con l'aumentare del numero di codoni rari nel gene di resistenza ag.......

Discussione

Il numero di codoni rari nei geni marcatori e nel mezzo di selezione o screening è fondamentale per inibire le espressioni proteiche dai geni marcatori raramente-modificato codoni. Se non è possibile rilevare alcuna differenza significativa tra le espressioni proteiche dei geni marcatori di tipo selvatico e i loro derivati, l'aumento del numero di codoni rari o l'utilizzo di un mezzo limitato dai nutrienti può amplificare le differenze. Tuttavia, se l'effetto di inibizione è troppo forte, le espressioni proteiche non pos.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acetonitrile	Thermo	51101
EasyPure HiPure Plasmide MiniPrep Kit	Transgen	EM111-01
EasyPure Quick Gel Extraction Kit	Transgen	EG101-01
Gibson assemblaggio master mix	NEB	E2611S
Isopropil β-D-1-tiogalattopiranoside	Solarbio	I8070
L-leucina	Sigma	L8000
Lettore di micropiastre	Biotek	Synergy 2
n-esano	Thermo	H3061
Fenil isotiocianato	Sigma	P1034
PrancerPurple CPB-37-441	ATUM	CPB-37-441
TransStar FastPfu Fly DNA polimerasi	Transgen	AP231-01
Trietilammina	Sigma	T0886
Cromatografia liquida ad altissime prestazioni	Agilent	1290 Infinity II
Wild type C. glutamicum	ATCC	13032
XL10-Gold E. coli cellula competente	Agilent	200314
ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 colonna	Agilent	959759-902K