Visualizando estrutura de linfonodos e localização celular usando microscopia confocal ex-vivo

Summary

Este protocolo descreve uma técnica para populações diferentes da pilha da imagem em drenar nós de linfa sem alterações na estrutura do órgão.

Abstract

Linfonodos (LNs) são órgãos espalhados dentro do corpo, onde as respostas imunes inatas podem se conectar com a imunidade adaptativa. Na verdade, os LNs são estrategicamente interpostos no caminho dos vasos linfáticos, permitindo o contato íntimo de antígenos de tecido com todas as células imunes residentes no LN. Assim, compreender a composição celular, a distribuição, a localização e a interação usando imagens de LN inteiras ex vivo acrescentarão ao conhecimento sobre como o corpo coordena as respostas imunes locais e sistêmicas. Este protocolo mostra uma estratégia ex vivo da imagem latente depois de uma administração in vivo de anticorpos fluorescente-etiquetados que permita uma metodologia muito reprodutível e fácil de executar usando microscópios confocal convencionais e reagentes do estoque. Através da injeção subcutânea de anticorpos, é possível rotular diferentes populações de células na drenagem de LNs sem afetar as estruturas teciduais que podem ser potencialmente danificadas por uma técnica de microscopia de imunofluorescência convencional.

Introduction

Os gânglios linfáticos (LNs) são órgãos em forma de ovóide amplamente presentes em todo o corpo com a função crucial de colmatar as respostas imunes inatas e adaptativas. Os LNs filtram a linfa a fim identificar partículas extrangeiras e pilhas cancerosas para montar uma resposta imune de encontro a elas¹. Células de apresentação de antígeno (APCs), células T e células B trabalham ao lado para gerar anticorpos antígeno-específicos (imunidade humoral) e linfócitos citotóxicos (imunidade celular) para eliminar as partículas estrangeiras e células cancerosas². Assim, compreender a dinâmica das células imunes presentes no sistema linfático terá implicações importantes para o desenvolvimento da vacina e a imunoterapia do câncer.

O advento de microscópios poderosos-incluindo novos microscópios confocais e de super resolução-permitiu um avanço extraordinário na compreensão de como diferentes populações de células imunes se comportam em seu ambiente nativo³. Agora é possível a imagem de vários subtipos de células simultâneas usando uma combinação de sondas com camundongos geneticamente modificados que expressam proteínas fluorescentes controle de alvos específicos^4,5. De fato, técnicas de alta dimensão, incluindo citometria de massas e análise de fluxo Multiparamétrico, têm sido cruciais para ampliar nosso conhecimento sobre diferentes compartimentos e funcionalidades da célula imune na saúde e na doença^{6, 7}. no entanto, para preparar amostras para estas técnicas, os tecidos necessitam de digestão e as células são separadas do seu ambiente natural para serem analisadas em suspensões celulares. Para superar essas limitações e permitir uma melhor tradução em biologia, o objetivo do protocolo proposto aqui é aplicar uma metodologia direta para a imagem de linfonodos inteiros ex vivo usando microscópios confocais de estoque com o benefício de velocidade melhorada, tecido preservação da estrutura, e viabilidade da pilha comparada à mancha convencional da imunofluorescência. Usando esta aproximação, nós pudemos mostrar que os ratos deficientes para as pilhas de ltγδ T, um SubType do linfócito de T envolvidos na defesa adiantada do anfitrião de encontro aos micróbios patogénicos⁴, têm os folículos comprometidos e as zonas da pilha de t em comparação aos ratos selvagens do tipo. Estes resultados permitiram que nós prosseguisse um estudo em que nós demonstramos que as pilhas de ltγδ T jogam um papel crítico na homeostase de órgãos lymphoid e da resposta imune humoral⁴. Além disso, este protocolo fornece um caminho fisiológico para sondas e anticorpos para alcançar o linfonodo, como eles são administrados por via subcutânea e dissipar-se através da circulação linfática do tecido, com base em relatos prévios que utilizaram a rotulagem in situ com anticorpos para visualizar as estruturas linfáticas-associadas^{8,9, a}dinâmica do centro germinais^10,11,12, e alvos prontamente acessíveis ao fluxo sanguíneo^{13 ,14,15}.

Protocol

O protocolo foi aprovado pelo Comitê Permanente de animais da faculdade de medicina de Harvard e do hospital Brigham and Women, protocolo 2016N000230. 1. camundongos utilizados para o experimento Use ratos machos e fêmeas velhos de 8 semanas no fundo B6 para administrar a mistura do anticorpo. Use camundongos CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT para determinar se a imagem latente completa ex vivo de ln pode igualmente ser aplicada aos ratos do repórter sem admin…

Representative Results

Este manuscrito mostra técnicas para remover linfonodos inguinal e poplítea sem prejudicar sua estrutura após a injeção de anticorpos fluorescentes rotulados para manchar populações de células específicas nesses órgãos (Figura 1 e Figura 2 ). A combinação poderosa de Immunolabeling de pilhas de ln com BV421 anti-CD4 e BB515 a análise da imagem latente de CD19 e confocal definiu a localização de pilhas de T (CD4 +) e de…

Discussion

A combinação da imagem latente com outras técnicas, incluindo a biologia molecular e o imunofenotipagem dimensional elevado realçou nossa habilidade de investigar pilhas imunes em seu contexto nativo. Na verdade, enquanto outras abordagens podem requerer digestão tecidual e isolamento celular-o que pode levar à perda de integridade tecidual-o uso de imagens in vivo ou ex vivo concede uma grande vantagem na investigação de diferentes subtipos de células em uma forma geográfica^{3 ,</su…}

Materials

BV421 anti-CD4	BD Horizon	562891	GK1.5; 0.2 mg mL-1
BB515 anti-CD19	BD Horizon	564509	1D3; 0.2 mg mL-1
BB515 Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Horizon	564418	R35-95; 0.2 mg mL-1
BV421 Mouse IgG2b, K Isotype Control	BD Horizon	562603	R35-38 0.2 mg mL-1
Cellview culture dish	Greiner-Bio	627861	35×10 mm with glass bottom
Insulin syringes	BD Plastipak	–	Insulin U-100
Kimwipes	Kimtech Science Brand	7557	size 21 x 20 cm / 100 sheets per box
Microsurgery curved forceps	WEP Surgical Instruments	custom made	12.5 cm
Microsurgery curved scissors	WEP Surgical Instruments	custom made	11.5 cm
Needle	BD PrecisionGlide	–	30 gauge × ½ inch
Nikon Eclipse Te + A1R confocal head	Nikon	–	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)
PE anti-F4/80	BD Pharmigen	565410	T45-2342; 0.2 mg mL-1
PE Rat IgG2a, κ Isotype Control	BD Pharmigen	553930	R35-95; 0.2 mg mL-1
Zeiss LSM 710 confocal microscope	Zeiss	–	loaded with main 4 laser lines (405, 488, 543 and 647 nm)