ワンポットビエンツマティックカスケードを確立することにより、フラバノンからのフラボノールの生合成
1College of Bioscience and Biotechnology,Yangzhou University, 2Key Laboratory of Prevention and Control of Biological Hazard Factors (Animal Origin) for Agrifood Safety and Quality, Ministry of Agriculture of China,Yangzhou University, 3Joint International Research Laboratory of Agriculture & Agri-Product Safety,Yangzhou University, 4Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, 5The Testing Center,Yangzhou University
Summary
フラボノールの誘導は、ヘルスケアおよび食品産業におけるその応用に不可欠です。ここでは、フラバノンからのフラボノールの生合成のための詳細なプロトコルを提供し、他のアプローチに対する重要なステップとその利点について議論する。
Abstract
フラボノールは、様々な生物学的および薬理学的活動を伴うフラボノイドの主要なサブクラスである。ここでは、フラボノールのインビトロ酵素合成の方法を提供する。この方法では、Atf3hおよびAtfls1は、フラボノールの生合成経路における2つの主要遺伝子を、エシェリヒア大腸菌においてクローニングおよび過剰発現する。組換え酵素は、アフィニティカラムを介して精製され、その後、特定の合成バッファーにビエンザイマティックカスケードが確立されます。2つのフラボノールは、例としてこのシステムで合成され、TLCおよびHPLC/LC/MS分析によって決定される。この方法は、他のアプローチよりもフラボノールの誘導に明らかな利点を表示します。それは時間と省力化および非常に費用効果が大きい。反応は正確に制御され易く、従って大量生産のためにスケールアップされる。対象製品は、システム内の単純なコンポーネントにより、簡単に精製できます。しかし, このシステムは、通常、フラバノンからフラボノールの生産に制限されます。.
Introduction
フラボノールは、植物フラボノイドの主要なサブクラスであり、植物の開発と色素沈着1、2、3に関与しています。さらに重要なことに、これらの化合物は、抗癌4、5、抗酸化6、抗炎症7、抗肥満8、抗高血圧症などの健康に有益な活動の広い範囲を有する、および記憶リコール特性10は、これらの植物由来二次代謝産物に関する多数の研究につながる。伝統的に、これらの化合物は、主に有機溶媒を用いた植物抽出に由来する。しかし、植物11、12、13の中身が非常に低いため、ほとんどのフラボノールの生産コストは高いままで、ヘルスケアや食品への応用に大きな制限を課しています。業界。
過去数十年の間に、科学者はフラボノイド14、15を導き出す方法のかなりの数を開発しました。しかしながら、これらの複雑な分子の化学合成は、種々の固有の欠点を有する16.それは有毒な試薬および極度な反応条件だけでなく、標的フラボノイド化合物14、17を産生するための多くのステップを必要とする。さらに、この戦略のもう一つの重要な課題は、活性フラボノイド分子のキラル合成です。したがって、化学合成16、17を介して商業規模でフラボノイドを生産することは理想的な戦略ではありません。
最近、科学者は、フラボノイド生合成18、19、20のための経路を持つ微生物を工学的にすることによって、これらの複雑な天然化合物を生成するための有望な代替戦略を開発しました。21歳,22は、植物23で正常に解読された。例えば、Duanらは、発芽酵母サッカロマイセスセレビシエに生合成経路を導入し、カエンフェロール(KMF)24を産生した。Mallaららは、グリコシル化フラボノールであるアストラガリンを産生し、フラバノン3-ヒドロキシラーゼ(f3h)、フラボノール合成酵素(fls1)、およびUDP-グルコース:フラボノイド3-O-グルコシルトランスフェラーゼUGT78K1遺伝子を導入した。エシェリヒア大腸菌BL21(DE3)17.かなりの数のパラダイムがあるにもかかわらず、すべての遺伝子組み換え微生物が細胞プラットフォームの複雑さ、人工的に合成された遺伝元素と宿主との間の非互換性のために関心のある製品を生成するわけではない。宿主細胞に対する標的産物の影響、および工学的細胞系自体の不安定性 16.
フラボノイド生産のためのもう一つの有望な代替戦略は、インビトロで多酵素カスケードを確立することです.Chengらは、エンテロシンポリケチドが1ポット25に完全な酵素経路を組み立てることによって正常に合成することができると報告している。この無細胞合成戦略は、微生物生産工場の制限を回避し、したがって、大量16でいくつかのフラボノイドを生産するために実現可能である。
最近では、ナリンゲニン(NRN)を1ポット16でKMFに変換するバイザイム合成システムの開発に成功しました。ここでは、このシステムについて詳しく説明し、製品の分析に関わる方法について説明します。また、このシステムを用いてNRNからKMFを生成し、エリオジチオール(ERD)からケルセチン(QRC)を生成する2つの例を示す。また、この方法の重要なステップと、フラボノイドの生合成における今後の研究の方向性についても議論する。
Protocol
1. 植物組織から総RNAを分離26,27 植物組織を均質化する。 新鮮な植物組織の100 mgを収集します(例えば、アラビドプシスタリアナから4週齢の苗)。液体窒素で組織と害虫とモルタルを凍結し、続いて組織を粉末に粉砕する。 モルタルにRNA単離試薬の1 mL(材料の表を参照)を追加します。試薬はすぐに凍結されま?…
Representative Results
F3HおよびFLS1は、図1に示すように、フラバノンを植物のフラボノールに変換する上で2つの重要な酵素である。フラバノンからフラボノールを製造するためのインビトロ生合成システムを開発するために、Atf3h(GenBank加盟No. NM_114983.3) とAtfls1 (GenBank アクセシビリティ No.NM_120951.3)遺伝子を4週齢のA.タリアナの苗から原核発現ベク?…
Discussion
かなりの数の研究は、ヘルスケアや食品業界での潜在的なアプリケーションにフラボノールの誘導に焦点を当てています。しかし、有機溶剤を用いた従来の植物抽出や化学合成には固有の欠点があり、フラボノールの製造に対する使用が制限されています。ここでは、インビエンザイマティックカスケードを確立することにより、フラバノンからフラボノールを1ポットで製造する詳細な方法…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、揚州大学特任教授スタートアップファンド、江蘇特別任教授スタートアップファンド、江蘇省6つのタレントピークプロジェクト(助成金第2014-SWYY-016)、およびプロジェクトが資金提供を受けて財政的に支援されました。江蘇省高等教育機関(獣医学)の優先学術プログラム開発我々は、フラボノイドのHPLCとMS分析のための陽州大学のテストセンターに感謝します。
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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Citazione di questo articolo
Zhang, Z., Fan, S., Chen, Z., He, Y., Huang, M., Ding, L., Zhang, Y., Chen, L., Zhang, X. Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade. J. Vis. Exp. (150), e59336, doi:10.3791/59336 (2019).