Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon durch Die Etablierung einer Ein-Topf-Bienzymatischen Kaskade
Summary
Die Ableitung eines Flavonols ist entscheidend für seine Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelindustrie. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Biosynthese eines Flavonols aus einem Flavanon zur Verfügung und diskutieren die entscheidenden Schritte und seine Vorteile gegenüber anderen Ansätzen.
Abstract
Flavonole sind eine der wichtigsten Unterklassen von Flavonoiden mit einer Vielzahl von biologischen und pharmakologischen Aktivitäten. Hier bieten wir eine Methode zur in vitro enzymatischen Synthese eines Flavonols. Bei dieser Methode werden Atf3h und Atfls1, zwei Schlüsselgene im biosynthetischen Weg der Flavonole, geklont und in Escherichia coliüberexprimiert. Die rekombinanten Enzyme werden über eine Affinitätssäule gereinigt und dann wird in einem spezifischen synthetischen Puffer eine bienzymatische Kaskade aufgebaut. Zwei Flavonole werden in diesem System als Beispiele synthetisiert und durch TLC- und HPLC/LC/MS-Analysen bestimmt. Die Methode zeigt offensichtliche Vorteile bei der Ableitung von Flavonolen gegenüber anderen Ansätzen. Es ist zeit- und arbeitssparend und sehr kostengünstig. Die Reaktion lässt sich einfach genau steuern und somit für die Massenproduktion hochskalieren. Das Zielprodukt lässt sich durch die einfachen Komponenten im System einfach reinigen. Jedoch, Dieses System ist in der Regel auf die Herstellung eines Flavonolaus aus einem Flavanon beschränkt.
Introduction
Flavonole sind eine wichtige Unterklasse von Pflanzenflavonoiden und sind an der Pflanzenentwicklung und Pigmentierung1,2,3beteiligt. Noch wichtiger ist, diese Verbindungen besitzen eine breite Palette von gesundheitsfördernden Aktivitäten, wie Anti-Krebs4,5, antioxidative6, entzündungshemmende7, Anti-Adipositas8, anti-hypertensive9 , und Speicher-Rückruf Eigenschaften10, was zu einer großen Anzahl von Studien über diese pflanzlichen abgeleiteten sekundären Metaboliten. Traditionell werden diese Verbindungen hauptsächlich aus der Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen. Aufgrund ihres sehr geringen Gehalts in den Werken11,12,13bleiben die Produktionskosten für die meisten Flavonole jedoch hoch, was ihre Anwendung im Gesundheitswesen und in der Lebensmittelversorgung stark eingeschränkt. industrie.
In den letzten Jahrzehnten haben Wissenschaftler eine ganze Reihe von Methoden entwickelt, um Flavonoide14,15abzuleiten. Die chemische Synthese dieser komplizierten Moleküle besitzt jedoch eine Vielzahl von intrinsischen Nachteilen16. Es erfordert nicht nur toxische Reagenzien und extreme Reaktionsbedingungen, sondern auch viele Schritte, um eine Ziel-Flavonoid-Verbindung14,17zu produzieren. Darüber hinaus ist eine weitere wichtige Herausforderung in dieser Strategie die chirale Synthese von aktiven Flavonoidmolekülen. Daher ist es keine ideale Strategie, Flavonoide im kommerziellen Maßstab über chemische Synthese16,17zu produzieren.
Kürzlich haben Wissenschaftler eine vielversprechende alternative Strategie entwickelt, um diese komplizierten natürlichen Verbindungen durch technische Mikroben mit einem Weg für Flavonoid-Biosynthese18,19,20, 21 , 22, die in Denbetrieben erfolgreich entziffert wurde23. Zum Beispiel, Duan et al. führte einen biosynthetischen Weg in die angehende Hefe Saccharomyces cerevisiae Kaempferol (KMF)24. Malla et al. produzierten Astragalin, ein glykosyliertes Flavonol, durch Einbringen vonFlavanon 3-Hydroxylase (f3h), Flavonol-Synthase (fls1) und UDP-Glucose:flavonoid 3-O-Glucosyltransferase UGT78K1-Genen di Escherichia coliBL21(DE3)17. Obwohl es eine ganze Reihe von Paradigmen gibt, produzieren nicht alle gentechnisch veränderten Mikroben die Produkte von Interesse aufgrund der Komplexität einer zellulären Plattform, der Inkompatibilität zwischen künstlich synthetisierten genetischen Elementen und Wirten, der hemmenden Wirkung von Zielprodukten gegen Wirtszellen und die Instabilität eines technischen Zellsystems selbst16.
Eine weitere vielversprechende Alternative zur Flavonoidproduktion ist die Etablierung einer multienzymatischen Kaskade in vitro. Cheng et al. haben berichtet, dass Enterocin-Polyketide erfolgreich synthetisiert werden können, indem sie einen kompletten enzymatischen Weg in einem Topf25zusammenstellen. Diese zellfreie synthetische Strategie umgeht die Beschränkungen einer mikrobiellen Produktionsfabrik und ist somit für die Herstellung einiger Flavonoide in großer Menge16machbar.
Kürzlich haben wir erfolgreich ein bienzym-synthetisches System entwickelt, um Naringenin (NRN) in KMF in einem Topf16umzuwandeln. Hier beschreiben wir dieses System ausführlich und die Methoden, die bei der Analyse der Produkte zum Einsatz kommen. Wir stellen auch zwei Beispiele vor, die dieses System verwenden, um KMF aus NRN und Quercetin (QRC) aus Eriodictyol (ERD) zu produzieren. Darüber hinaus diskutieren wir entscheidende Schritte dieser Methode und zukünftige Forschungsrichtungen in der Biosynthese von Flavonoiden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine ganze Reihe von Studien konzentrieren sich auf die Ableitung von Flavonolen aufgrund ihrer möglichen Anwendung in der Gesundheits- und Lebensmittelindustrie. Die traditionelle Pflanzenextraktion mit organischen Lösungsmitteln und der chemischen Synthese hat jedoch intrinsische Nachteile, die ihre Verwendung bei der Herstellung von Flavonolen einschränken. Hier berichten wir über eine detaillierte Methode zur Herstellung eines Flavonols aus einem Flavanon in einem Topf, indem wir eine in vitro bienzymatische Kask…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt von yangzhou University Specially Appointed Professor Start-up Funds, Jiangsu Specially Appointed Professor Start-up Funds, Six Talent Peaks Project in Jiangsu Province (Grant No. 2014-SWYY-016) und einem Projekt, das von die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (Veterinärmedizin). Wir danken dem Testing Center der Yangzhou University für HPLC- und MS-Analysen von Flavonoiden.
Materials
| 2× Pfu MasterMix | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0717A | PCR amplification of genes with high fidelity |
| Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system | Agilent Technologies, Inc | N/A | an equipment for analysis of flavonoids by HPLC/MS |
| Agilent MassHunter Workstation (version B.03.01) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for collection of the data from the Agilent 1200 Series RRLC system with an Agilent 6460 Triple Quadrupole LC/MS system |
| dihydrokaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 91216 | intermediate product for producing kaempferol from naringenin |
| dihydroquercetin | Sichuan Provincial Standard Substance Center for Chinese Herbal Medicine | PCS0371 | intermediate product for producing quercetin from eriodictyol |
| DNA Clean-up Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2301 | purification of PCR-amplified or gel-purified DNA |
| eriodictyol | Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd. | B21160 | substrate for producing quercetin |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0809 | bacteria strain for expressing target genes |
| Escherichia coli DH5α | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0808 | bacteria strain for plasmid proliferation |
| FreeZone 1 Liter Benchtop Freeze-Dry System | Labconco Corporation | 7740020 | an equipment for freeze-drying of flavonoids dissolved in organic solvent |
| Gel Extraction Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW2302 | purification of a DNA band from an agarose gel |
| Gel Imaging System | Shanghai Tanon Science & Technology Co. Ltd. | Tanon- 2500 |
an equipment for visualization of DNA band on an agarose gel or flavonoid spot on a polyamide TLC plate |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich Co. LLC | PLN350-1KT | minipreparation of plasmids |
| kaempferol | Sigma-Aldrich Co. LLC | 60010 | final reaction product and standard substance |
| MassHunter Quanlitative Analysis (version B.01.04) | Agilent Technologies, Inc | N/A | a software for analysis of HPLC/LC/MS data |
| NanoDrop Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-8000-GL | an equipment for determination of DNA/RNA concentration |
| naringenin | Sigma-Aldrich Co. LLC | N5893 | substrate for producing kaempferol |
| Ni-IDA Agarose Resin | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0010 | purification of His-tagged fusion proteins |
| pET-32a(+) | Novagen | 69015-3 | plasmid for cloning and expressing target genes |
| plasmid sequencing | GENEWIZ Suzhou | N/A | sequencing of recombinant plasmids |
| primer synthesis | GENEWIZ Suzhou | N/A | synthesis of PCR primers |
| quercetin | Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd. | Q111273 | final reaction product and standard substance |
| SuperRT cDNA Synthesis Kit | Beijing CoWin Biotech Co., Ltd | CW0741 | synthesis of the first strand of cDNA from total RNA |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0016 | ligation of an insert into a linearized vector DNA |
| Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | isolation of total RNA |
| Vector NTI Advance | Thermo Fisher Scientific | 12605099 | a software for PCR primer design and DNA sequence analysis |
| Xcalibur v2.0.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | a software for analysis of HPLC data |
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