בידול קיבולת של האדם-אבי העורקים Perivascular שומן ובתאים
Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לבחון את היכולת של ובתאים נגזר רקמת שומן perivascular האדם להתמיין שושלות תאים מרובים. בידול היה לעומת גזע mesenchymal הנגזרות מח אנושי, אשר ידועה להבדיל לתוך adipocyte, osteocyte ו- chondrocyte שושלות.
Abstract
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, ו chondrogenic שושלות. Adipogenic הבידול של ובתאים הוא מנגנון מרכזי הנהיגה הרחבה רקמת שומן ועל תפקוד בתגובה השמנת יתר. הבנת שינויים רקמת שומן perivascular (PVAT) היא לפיכך הרלוונטית קלינית במחלה מטבולית. עם זאת, מחקרים קודמים היו יוכפל לאחר המרתו הופיעה העכבר, חיה אחרת מודלים. פרוטוקול זה משתמש אנושי דגימות PVAT בית החזה שנאספו בחולים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. רקמת שומן מן העורקים נאסף ומשומשים עבור explantation של השבר בכלי הדם סטרומה. לנו קודם לכן אישר את הנוכחות של אדיפוז ובתאים ב PVAT האדם את היכולת להתמיין המכילים שומנים בדם adipocytes. במחקר זה, בהמשך ניתחנו את פוטנציאל התמיינות של תאים מן השבר בכלי הדם סטרומה, ככל הנראה המכיל ובתאים רב עוצמה. השווינו נגזר PVAT לתאי מח עצם האדם MSC עבור בידול לתוך adipogenic, osteogenic, chondrogenic שושלות. לאחר 14 ימים של בידול, כתמים מסוימים נוצלו לאתר הצטברות שומנים בדם adipocytes (שמן אדום O), פיקדונות calcific תאים osteogenic (Alizarin אדום), או glycosaminoglycans, קולגן בתאים chondrogenic (Trichrome של מאסון). בזמן מח העצם MSC ביעילות הבדיל לתוך כל שלוש שושלות, תאים PVAT, נגזר היה adipogenic ו- chondrogenic פוטנציאל, אבל חסרה פוטנציאל osteogenic חזקים.
Introduction
רקמת שומן הוא מקור עשיר ורב עוצמה בתאי גזע mesenchymal (MSC) מסוגל להבדיל לתוך osteogenic, adipogenic, chondrogenic שושלות1. רקמה זו מרחיבה דרך היפרטרופיה של בוגרת adipocytes de novo הבידול של תושב MSC כדי adipocytes. רקמת שומן Perivascular (PVAT) המקיף את כלי הדם, מווסת את תפקוד כלי הדם2,3. השמנת יתר-induced PVAT הרחבה מחריף פתולוגיות לב וכלי דם. ואילו הפוטנציאל multipotent של MSC מן האדם מחסני אדיפוז תת עורית כבר למד היטב4,5, מחקר explanted, הערכת הקיבולת בידול של האדם נגזר PVAT ובתאים, סביר בשל invasiveness הרכש. לפיכך, מטרת עבודה זו היא לספק מתודולוגיה אל explant, להפיץ ובתאים של האדם PVAT של אבי העורקים של חולים עם מחלת לב וכלי דם, כדי לבדוק את הנטייה להבחין ל osteogenic, chondrogenic ו adipogenic שושלות שלהם. מקור שלנו PVAT הוא אתר של השקה של המעקף על עולה אבי העורקים של חולים שמנים שעברו ניתוח השתלת מעקף של עורקים. PVAT בודדים טרי enzymatically-חלופה מועדפת, השבר בכלי הדם סטרומה בודד ולאחר מופצות במבחנה, ומאפשרת לנו לבחון בפעם הראשונה את יכולת התמיינות של האדם נגזר PVAT ובתאים.
השימוש העיקרי תרבותי אנושי PVAT סטרומה וסקולרית שבר, בדקנו שלושה מבחני מתוכנן לגרום גזע/ובתאים להבדיל לכיוון adipogenic, osteogenic, או chondrogenic שושלות. המחקר שלנו מוקדמת לזהות אוכלוסייה של CD73 + CD105 +, תאים PDGFRa + (CD140a) יכולים להתמיין robustly adipocytes6, למרות multipotency שלהם לא נבדקה. PVAT ישירות מסדיר את הטון ודלקת כלי הדם7. הרציונל לבדיקת הפוטנציאל בידול של אוכלוסייה זו תא הרומן היא להתחיל להבין את השפעת PVAT על תפקוד כלי דם מיוחדות, ומנגנונים של התרחבות PVAT במהלך השמנת יתר. מתודולוגיה זו משפרת את ההבנה שלנו של הפונקציות של רקמת שומן נגזרת ובתאים, מאפשרת לנו לזהות ולהשוות והשונה של ובתאים ממקורות רקמות שונות. עלינו לבנות על גישות הוקמה המאומת בידוד, המבדילים MSC לכיוון שושלות שונות, לייעל את ההליכים כדי למקסם את הכדאיות של האדם נגזר PVAT ובתאים. טכניקות אלה יש שימושים רחב בתחומים של גזע קדמון תא רקמת שומן ומחקר ופיתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
אדיפוז ובתאים של מחסני שונים להשתנות באופן נרחב פוטנציאליים, פנוטיפ ובידול9. Culturing נגזר PVAT אבות מתורם יחיד החולה באינדוקציה סימולטני למטה שלוש שושלות שונות, adipogenic, osteogenic, ו chondrogenic, מאפשר חקירה ומבוקרות היטב pluripotent לקיבולת של הרומן הזה אוכלוסיית ובתאים. המתודולוגיה שתוארו בדו ח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו להכיר את הסיוע של ניווט המחקר במרכז הרפואי מיין עבור סיוע הרכש של רקמות קליני, ואת Histopathology ליבה Histomorphometry (נתמך על-ידי 1P20GM121301, ל Liaw PI)-המחקר במרכז הרפואי מיין מכון חלוקתה, מכתים. עבודה זו נתמכה על ידי NIH להעניק R01 HL141149 (ל’ Liaw).
Materials
| animal-free collagenase/dispase blend I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Alcian Blue | NewComerSupply | 1003A | 1% Aqueous solution pH 2.5 |
| Alizarin Red | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher | 12561056 | |
| Aniline Blue | NewComerSupply | 10073C | |
| antibiotic/antimycotic | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich's scarlet acid fuchsin | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glycerophosphate | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| biotin | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Bouin's fixative | NewComerSupply | 1020A | |
| bovine serum albumin | Calbiochem | 12659 | stored at 4C |
| Cell detachment solution | Accutase | AT104 | |
| cell strainer (70mm) | Corning | 352350 | |
| dexamethasone | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4.5g/L glucose, L-glut and pyruvate |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 10565-042 | high glucose, glutamax, sodium bicarbinate |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| formalin | NewComerSupply | 1090 | |
| gelatin, bovine skin | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| glutamax | ThermoFisher | 35050061 | glutamine supplement |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| insulin solution | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Oil red O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| pantothenic acid | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| penicillin-streptomycin solution | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| permount | Fisher | SP15-500 | |
| phosphotungstic/phosphomoybdic acid solution | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Antimicrobial reagent for culture media. |
| rosiglitazone | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Weigert's hematoxylin | EKI | 4880-100G |
Riferimenti
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C. Perivascular adipose tissue as a regulator of vascular disease pathogenesis: identifying novel therapeutic targets. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3411-3424 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Bunnell, B. A., Estes, B. T., Guilak, F., Gimble, J. M. Differentiation of adipose stem cells. Methods in Molecular Biology. , 155-171 (2008).
- Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a Regulates Human Perivascular Adipose Progenitor Cell Differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Nosalski, R., Guzik, T. J. Perivascular adipose tissue inflammation in vascular disease. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3496-3513 (2017).
- Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. The International Journal of Developmental Biology. 51 (8), 723-729 (2007).
- Cleal, L., Aldea, T., Chau, Y. Y. Fifty shades of white: Understanding heterogeneity in white adipose stem cells. Adipocyte. 6 (3), 205-216 (2017).
- de Souza, L. E., Malta, T. M., Kashima Haddad, S., Covas, D. T. Mesenchymal Stem Cells and Pericytes: To What Extent Are They Related. Stem Cells and Development. 25 (24), 1843-1852 (2016).
- Majesky, M. W. Adventitia and perivascular cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (8), e31-e35 (2015).
- Miana, V. V., Gonzalez, E. A. P. Adipose tissue stem cells in regenerative medicine. Ecancermedicalscience. 12, 822 (2018).
- Frese, L., Dijkman, P. E., Hoerstrup, S. P. Adipose Tissue-Derived Stem Cells in Regenerative Medicine. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 43 (4), 268-274 (2016).
- Mizuno, H., Tobita, M., Uysal, A. C. Concise review: Adipose-derived stem cells as a novel tool for future regenerative medicine. Stem Cells. 30 (5), 804-810 (2012).
- Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
- Safford, K. M., et al. Neurogenic differentiation of murine and human adipose-derived stromal cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294 (2), 371-379 (2002).
- Ashjian, P. H., et al. In vitro differentiation of human processed lipoaspirate cells into early neural progenitors. Plastic and Reconstructive Surgery. 111 (6), 1922-1931 (2003).
- Trottier, V., Marceau-Fortier, G., Germain, L., Vincent, C., Fradette, J. IFATS collection: Using human adipose-derived stem/stromal cells for the production of new skin substitutes. Stem Cells. 26 (10), 2713-2723 (2008).
- Thelen, K., Ayala-Lopez, N., Watts, S. W., Contreras, G. A. Expansion and Adipogenesis Induction of Adipocyte Progenitors from Perivascular Adipose Tissue Isolated by Magnetic Activated Cell Sorting. Journal of Visualized Experiments. (124), (2017).
