Articolo metodologico

Un modello di topo ortotopico oncogenico indotto dall'epatocito del cancro epatocellulare in aumento nell'impostazione dell'infiammazione epatica e della fibrosi

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DOI:

10.3791/59368

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12 settembre 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Missouri-Columbia, 2Ellis Fischel Cancer Center, University of Missouri-Columbia, 3Molecular Microbiology and Immunology, University of Missouri-Columbia

Autori corrispondenti: Kevin F. Staveley-O'Carroll <ocarrollk@health.missouri.edu>, Guangfu Li <liguan@health.missouri.edu>

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo lo sviluppo di un modello murino clinicamente rilevante del cancro al fegato che riassume le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC).

Abstract

L'assenza di un modello animale clinicamente rilevante che affronti le caratteristiche immunitarie tipiche del cancro epatocellulare (HCC) ha ostacolato significativamente la chiarimento dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative. Per sviluppare un modello animale ideale che riassume l'HCC umano, i topi maschi immunocompetenti C57BL/6J ricevono prima un'iniezione di tetracloruro di carbonio (CCl4)per indurre la fibrosi epatica, quindi ricevono epatociti oncogenici istogenici-normali dal giovane maschio L'antigene SV40 T (TAg)-mice transgenico (MTD2) per inoculazione intrasplenica (ISPL). Androgeno generato in topi maschi destinataria alla pubertà avvia l'espressione TAg sotto il controllo di un promotore specifico del fegato. Di conseguenza, gli epatociti trasferiti diventano cellule tumorali e formano masse tumorali nell'impostazione della fibrosi epatica/cirrosi. Questo nuovo modello imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC nel contesto della fibrosi/cirrosi epatica e riflette le caratteristiche più tipiche dell'HCC umano, inclusa la disfunzione immunitaria.

Introduzione

Il cancro epatocellulare (HCC) è il tipo di cancro in più rapido aumento negli Stati Uniti (USA)1,2,3. Ogni anno, circa 850.000 nuovi casi vengono diagnosticati4,5 e 700.000 pazienti muoiono per questa malattia letale6,7,8,9,10 , rendendola la seconda causa più alta di morte legata al cancro al mondo. La gestione dell'HCC comprende resezione chirurgica, trapianto, ablazione, chemioembolizzazione, o terapie sistemiche, come sorafenib11. La diagnosi precoce e la gestione con resezione chirurgica o trapianto hanno il più alto beneficio di sopravvivenza complessiva4. Purtroppo, la maggior parte dei pazienti presentano in una fase successiva e richiedono la gestione con ablazione, chemioembolizzazione o sorafenib12. Sorafenib, un inibitore della chinasi recettore (RTKI), è stato approvato dalla Food and Drug Administration nel 2008 come l'unica terapia farmacologica sistemica disponibile per il trattamento di HCC non aggiornabile. Anche se il farmaco fornisce solo un modesto aumento della sopravvivenza complessiva, da 7,9 a 10,7 mesi13, ha fornito una nuova strategia terapeutica che potrebbe essere utilizzata per gestire l'HCC.

La manipolazione del sistema immunitario per eliminare i tumori stabiliti è un settore in rapida crescita nella ricerca sul cancro14. Gli studi sui checkpoint immunitari hanno notevolmente avanzato lo sviluppo di farmaci immunoterapeutici nel trattamento del cancro15,16. La FDA ha approvato l'uso di anticorpi (Abs) contro l'antigene citotossico T-linfocito 4 (CTLA-4), la proteina di morte cellulare programmata 1 (PD-1), e la sua PD-L1 legante per il trattamento del melanoma, del cancro ai polmoni, al cancro della testa e del collo e cancro alla vescica17, 18 mi lato , 19 del 12 , 20.Le sperimentazioni cliniche di monoterapia o terapia combinata utilizzando uno o più anticorpi contro PD-1, PD-L1 o CTLA-4 per il trattamento di HCC avanzato sono in corso21,22,23e alcuni hanno mostrato risultati favorevoli. Nel 2017, la FDA ha concesso l'approvazione accelerata per gli anticorpi anti-PD-1 per il trattamento dei pazienti HCC, che sono resistenza allo sorafenib, ma il tasso di risposta complessivo di questa terapia è solo del 14,3%. Altre strategie non sono state tradotte in pratica clinica in questo momento24,25. Superare la tolleranza immunitaria profonda indotta dal tumore per migliorare la terapia del checkpoint immunitario26; prevedere l'efficacia della terapia con checkpoint immunitario; prevenire eventi avversi legati al sistema immunitario; ottimizzazione del percorso amministrativo, del dosaggio e della frequenza; e trovare combinazioni efficaci di terapie27,28,29 tutti rimangono compiti estremamente impegnativi.

Ci sono diversi approcci convenzionali utilizzati per indurre HCC nei modelli murini attualmente e sono utilizzati a seconda della particolare domanda di ricerca dello sperimentatore30. I modelli murini HCC indotti chimicamente con composti genotossici imitano la malignità indotta da lesioni. I modelli di Xenotrapianto attraverso l'impianto ectopico o ortotopico delle linee cellulari HCC sono adatti per lo screening farmacologico. Un certo numero di topi geneticamente modificati sono stati progettati per studiare la fisiofisiologia dell'HCC. I topi transgenici che esprimono geni virali, oncogeni e/o fattori di crescita consentono l'identificazione delle vie coinvolte nell'epatocarcinogenesi. A causa di limitazioni intrinseche, questi modelli non riassumono le caratteristiche immunitarie tipiche osservate nell'HCC umano, il che ha ostacolato significativamente la chiarificazione dei meccanismi sottostanti e lo sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative14 ,15. Recentemente abbiamo creato un modello murino clinicamente rilevante. Questo nuovo modello non solo imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC, ma riflette anche le caratteristiche più tipiche della malattia umana, inclusa la disfunzione immunitaria. Abbiamo caratterizzato le sue caratteristiche biologiche e immunologiche. Sfruttando questo nuovo modello, abbiamo esplorato varie strategie immunoterapeutiche per trattare HCC31,32,33,34,35,36, 37. Questa piattaforma unica ci permette di studiare i meccanismi dell'immunotolleranza indotta dal tumore e di sviluppare strategie terapeutiche proof-of-concept per l'HCC verso un'eventuale traduzione clinica.

Protocollo

NOTA: Tutta la procedura, inclusi i soggetti animali, è stata approvata dall'IACUC presso l'Università del Missouri. Tutti i topi hanno ricevuto cure umane secondo i criteri delineati nella "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio". La seguente procedura per l'isolamento cellulare e l'inoculazione deve essere eseguita in un cofano. Tutti gli esecutori devono indossare l'attrezzatura protettiva personale standard per la manipolazione dei topi e dei tessuti.

1. Induzione di fibrosi e cirrosi del fegato con iniezione IP di tetracloruro di carbonio (CCl4)

NOTA: vedere la figura 1. (CCl4 è reagente altamente pericoloso, deve essere maneggiato con attenzione e indossando guanti resistenti alle sostanze chimiche)

  1. Ottenere topi maschi C57BL/6J di età di sei-otto settimane (vedere Tabella dei materiali).
  2. Preparare la soluzione 10% CCl4 (v/v) nell'olio di mais in un tubo di centrifuga. Determinare il volume totale in base al numero di mouse da inimettere (vedere il passaggio 1.6).
  3. Utilizzare la tecnica di manipolazione dei mouse appropriata per selezionare un mouse per l'iniezione.
  4. Trattenere manualmente il mouse con il suo lato dorsale (addome) verso l'alto.
  5. Pulire il sito di iniezione sulla parete addominale del topo strofinando con 70% alcol.
  6. Iniettare i topi maschi C57BL/6J con 160 gradi l di 10% soluzione CCl4 mediante iniezione intraperitoneale (IP) utilizzando un ago monouso da 25 calibro.
  7. Assicurarsi che l'ago penetri appena attraverso la parete addominale (circa 4-5 mm) con smusso rivolto verso l'alto e leggermente angolato a 15-20 gradi.
  8. Iniettare i topi due volte a settimana per un totale di quattro settimane-ogni topo riceverà un totale di otto iniezioni.
    NOTA: Due settimane dopo l'ultima iniezione, i topi trattati sono pronti per l'inoculazione ISPL di epatociti oncogeni da topi MTD2.

2. Isolamento degli epaticiti tag transgenici dai topi Line MTD2

NOTA: vedere la Tabella 1 per le ricette della soluzione.

10x Soluzione di sale bilanciato di Earle senza Ca o Mg (EBSS senza Ca o Mg)4 g di KCl
68 g NaCl
1,4 g NaH2PO4 H2o
10 g di destrosio
Aggiungere acqua a 1 litro, pH a 4,32
Filtro passa attraverso
Soluzione 120 mL 10x EBSS senza Ca o Mg
44 g di NaHCO3
1,33 mL 1,5M Di hepes
10 mL da 10 mL EGTA
Aggiungere acqua a 200 mL
Soluzione 2100 mL 10x EBSS
2,2 g NaHCO3
6,67 mL 1,5 M Hepes
Aggiungere acqua a 1 litro
Soluzione di collagenasi dello 0,75%15 mg di collagenasi tipo 1
20 mL della soluzione 2
Mezzo completo2 giri al rin
50 mL FBS
5 mL 100x Penicillina-Streptomicina

Tabella 1: Ricette di soluzione.

  1. Ottenere la linea MTD2 topi38 per servire come fonte di epatociti oncogenici.
  2. Anestesizzai i topi MTD2 di 5 settimane usando il 2,5% di isoflurane.
    NOTA: l'anestesizzazione corretta verrà controllata con il metodo del pizzico dei dipighi. In breve, con due dita, dare il topo del mouse / piede una buona stretta. Se non c'è una reazione di astinenza, l'animale viene giudicato abbastanza profondo da iniziare l'intervento chirurgico.
  3. Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi in una posizione supina e fissare le estremità con nastro adesivo per fornire un'adeguata esposizione della superficie addominale.
  4. Eseguire un'incisione laparotomia mediana utilizzando forbici lungo la lunghezza della linea alba abbastanza grande da fornire un'adeguata esposizione del fegato.
  5. Sposizionare l'intestino a sinistra per fornire una migliore esposizione del fegato e triade portale.
  6. Dissezitto sopra il fegato per esporre la vena cava inferiore (IVC).
  7. Ligate l'IVC sopra il fegato utilizzando un morsetto dell'arteria.
  8. Tornando al bordo inferiore del fegato, utilizzare un ago farfalla (vedi materiali) per ottenere l'accesso IV alla vena del portale. Fissare il catetere a mano.
  9. Successivamente perfondere il fegato del topo utilizzando una siringa di iniezione a 8,9 mL/min con 15 mL di soluzione 1, 15 mL di 0.75% soluzione collagenasi 2, e 15 mL di soluzione 2 tramite il catetere.
  10. Raccogliere il fegato perfuso tagliando e prendendo la massa tumorale dai topi MTD2 in un tubo conico 50 mL con 10-15 mL di PBS.
  11. Rimuovere PBS e lavare un tempo aggiuntivo con PBS; non centrifugare in questo passaggio.
  12. Tagliare il fegato in pezzi più piccoli utilizzando le forbici e poi lavare di nuovo con PBS 2x per rimuovere il sangue rimanente.
  13. Aggiungere 5 mL di mezzo RPMI completo al tubo conico e tritare continuamente il fegato con le forbici a piccoli pezzi (<3 mm) tessuto dovrebbe passare senza intoppi attraverso una pipetta 5 mL.
  14. Aggiungere l'RPMI completo a un volume finale di 30 mL e sospendere il fegato utilizzando una pipetta da 5 mL.
  15. Filtrare la soluzione mista con un colino da 70 m in un tubo conico da 50 ml.
  16. Lavare il colino più volte con RPMI completo e regolare il volume finale a 50 mL aggiungendo ulteriore supporto RPMI.
  17. Ruotare rapidamente la sospensione con una centrifuga fino a un massimo di 500 giri/min; una volta che la velocità è accelerata a 50 x g, la centrifuga deve essere fermata.
  18. Decant il supernatante e sospendere pellet in 20 mL di PBS.
  19. Contare le cellule utilizzando l'esclusione blu Trypan e un emocitometro, quindi regolare la concentrazione cellulare a 2,5 x 106/mL per la seguente inoculazione cellulare.
    NOTA: Il rendimento previsto da 5 grammi di tessuto tumorale è 80 milioni di epatociti con vitalità >95%.

3. Inoculare gli epatociti dai topi MTD2 al fegato di topi selvatici C57BL/6J mediante iniezione ISPL

  1. La tecnica asettica deve essere utilizzata in tutte le procedure
  2. Anestesizzare i topi maschi CCl4trattati C57BL/6J con 2,5% isoflurane, i topi devono essere trattati con lubrificante oculare per evitare che gli occhi si asciughino.
  3. Preparare le siringhe con 200 o più l of epatociti per l'iniezione.
  4. Quando adeguatamente sedati, posizionare i topi con il lato sinistro verso l'alto.
  5. Rasare l'intero fianco sinistro dei topi, quindi strofinare l'area, alternando tra 70% alcol e betadine tre volte.
  6. Somministrare 5 mg/kg di carprofen sottocutaneamente prima dell'incisione chirurgica.
  7. Fai un'incisione di 1 cm sul fianco sinistro parallela alla costola 13dall'estremo dorsale che inizia appena sotto il muscolo della colonna vertebrale.
  8. Identificare la milza, quindi esternarla con pinze a punta smussata.
  9. Ritagliare la milza con due clip in titanio di medie dimensioni. Posizionare entrambe le clip tra l'arteria splenica e la vena, lasciare spazio tra le clip per tagliare in seguito dopo l'inoculazione.
    NOTA: L'obiettivo è quello di isolare il polo inferiore della milza per ridurre il rischio di semina.
  10. Iniettare 200 l (0,5 milioni) degli epatociti preparati nel polo inferiore della milza utilizzando un ago da 27 G.
  11. Ritagliare il ramo inferiore del pedicolo (vasi a palo splenico inferiori) con una clip di medie dimensioni.
  12. Tagliare la milza tra le due clip posizionate inizialmente.
  13. Rimuovere il polo inferiore della milza che è stato iniettato direttamente con cellule tumorali.
  14. Utilizzare 3-0 polyglactin 910 interrotto sutura per chiudere lo strato muscolare interno.
  15. Utilizzare clip di ferita d'acciaio sterilizzato per chiudere lo strato cutaneo esterno.
    NOTA: Le clip in acciaio sono preferite rispetto alle suture per evitare che gli animali mastichino le suture, lasciando una ferita spalancata.
  16. Somministrare 5 mg/kg di carprofen subcutaneo dopo la sutura.
  17. Posizionare tutti gli animali che recuperano su un cuscinetto di riscaldamento a temperatura controllata e monitorare attentamente fino a completa ripresa dall'anestesia.
  18. Dare ai topi libero accesso all'acqua dopo l'intervento chirurgico. Se il topo si disidrata durante l'intervento chirurgico, somministrare i fluidi sottocutanei (<1 mL).
  19. Rimuovere le clip della pelle a 7-10 giorni post-operatori.

Risultati

Gli epatociti oncogeni isolati dai topi transgenici TAg (Figura 2) sono stati seminati nel fegato di topi selvatici mediante iniezione intrasplenica (Figura 3). Gli epatociti trapiantati con successo e in modo affidabile sono cresciuti con successo e in modo affidabile tumori HCC ortotopici (Figura 4) con antigene tumorale specifico SV40 TAg (Figura 5) nell'impostazione di infiammazione epatica e fibrosi ( Figura1).

figure-results-1
Figura 1: Schema per la preparazione del modello di mouse di HCC. Il progetto sperimentale per stabilire un innovativo modello murino di HCC. I topi C57BL/6J vengono prima trattati con iniezione IP di CCl4 due volte alla settimana per quattro settimane per indurre la fibrosi epatica. Due settimane dopo l'ultima iniezione di IP, i topi trattati con CCl4ricevono epatociti isolati da topi MTD2 giovani maschi tramite l'inoculazione ISPL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Isolamento e purificazione degli epatociti dai topi MTD2 di linea. (A) Gli epatociti isolati dai topi MTD2 sono stati preparati secondo il protocollo e macchiati di blu trypan per rilevare la vitalità e la purezza dell'isolamento cellulare.  Il pannello sinistro mostra sia gli epatociti (freccia nera) che i linfociti infiltrati nel tumore (frecce rosse) che sono isolati durante l'estrazione delle cellule.  Il pannello destro mostra la popolazione cellulare rimasta dopo la centrifugazione a bassa velocità, compresi gli epatociti (freccia nera) e significativamente meno linfociti infiltranti tumorali. Ingrandimento : obiettivo 10x, barra della scala - 100 m. (B) Gli epatociti isolati dai topi MTD2 sono macchiati con soluzione blu trypan prima dell'inoculazione di topi di tipo selvatico C57BL/6J.  L'isolamento delle celle è determinato per avere successo se la vitalità è >95%.  Le cellule morte saranno macchiate con il trypan blu (frecce rosse), mentre le cellule vitali non saranno macchiate (freccia nera).  Ingrandimento - obiettivo 10x, barra della scala 100 m. Il grafico a destra mostra i risultati dell'isolamento cellulare con >95% degli epatociti vitali, i dati statistici provengono da 5 diversi campi osservati al microscopio; le barre di errore rappresentano :SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-3
Figura 3: Inoculazione intrasplenica di epatociti nel fegato di topi selvatici C57BL/6J.  Il progetto sperimentale per l'inoculazione ISPL di epatociti per indurre HCC in topi C57BL/6J. (1) La milza viene identificata ed esternalizzata. (2) La milza viene ritagliata con due clip in titanio di medie dimensioni. (3) Gli epatociti preparati vengono iniettati nel polo inferiore della milza. (4) Il ramo inferiore del pedicolo (vasi a palo splenico inferiori) viene ritagliato con una clip di medie dimensioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-4
Figura 4: Sviluppo progressivo del tumore nei topi C57BL/6J dopo l'inoculazione con MTD2-epatociti. (A) Il modello tumorale ortotopico del carcitocellulare epatocellulare (HCC) è stato stabilito secondo il protocollo. Le immagini anatomiche sono state scattate prima dell'inoculazione e ai corsi di tempo subsequenziali. (a) Mostra fegato sano prima dell'inoculazione con epatociti MTD2. (b) Fegato del topo 3 mesi dopo l'inoculazione con evidenza di sviluppo grave del tumore. (c) 3,5 mesi dopo l'inoculazione con aumento del carico tumorale. d) 4,5 mesi dopo l'inoculazione. e) 6 mesi dopo l'inoculazione con evidenza di tumore in tutto il fegato. (B) I noduli tumorali sono stati raccolti e pesati nei punti temporali indicati dopo l'inoculazione con epatociti MTD2.  Le barre di errore rappresentano :SD.  (C) Immagini rappresentative di sezioni di fegato selvatiche e epatiche inoculate da MTD2. La colorazione ematossina ed eosina (H&E) raffigura la formazione pseudogland (frecce nere). C'è l'affollamento nucleare, e le cellule tumorali sono eosinofilicone con alti rapporti nucleo-citoplasma (immagine ingrandita). Ingrandimento - obiettivo 20x, barra della scala - 50 m. Gli inset in alto a destra vengono ulteriormente amplificati manualmente. (D) Colorazione rossa Sirio che indica la deposizione anormale di collagene, coerente con la fibrosi epatica. Ingrandimento: obiettivo 40x, barra della scala 20 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-5
Figura 5: Rilevamento specifico del gene dell'antigene SV40 T nel tumore.  (A) Sono stati raccolti tessuti tumorali e campioni di tessuto aggiuntivi in tutti i topi.  Il DNA genomico è stato isolato dai tessuti e i primer sia per SV40 T Ag che per P53 (controllo) sono stati sintetizzati per la PCR convenzionale. Il gene dell'antigene SV40 T è stato rilevato nel tessuto tumorale, ma non è presente né nel tessuto normale né in un altro tessuto nei topi. (B) Il tessuto tumorale è stato raccolto da topi tumorali e macchiato con antigene antigene anti-SV40 T. Il pannello sinistro è un controllo negativo dal tessuto epatico sano raccolto da topi ingenui.  Il pannello destro mostra una significativa colorazione dell'antigene SV40 T del tessuto tumorale raccolto da topi tumorali (colore marrone).  Ingrandimento - obiettivo 40x, barra della scala - 20 m. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Con questo protocollo, abbiamo stabilito un modello murino affidabile e riproducibile di HCC che imita l'inizio e la progressione umana dell'HCC. Clinicamente, molti fattori di rischio successivamente inducono lesioni epatiche, fibrosi epatica, cirrosi e la fase finale di HCC. Nel nostro protocollo, l'iniezione IP di CCl4 viene utilizzata per produrre prima fibrosi epatica in topi selvatici, che consente ai successivi epatociti oncogeni di formare i tumori nell'impostazione della fibrosi epatica. Abbiamo scoperto che la formazione di tumori si è verificata con maggior successo nei topi che hanno ricevuto l'inoculazione dell'epatocito due settimane dopo il trattamento con CCl4, rispetto ai topi che hanno ricevuto iniezioni in altri punti temporali. Inoltre, abbiamo scoperto che la fibrosi epatica può essere rilevata fino a quattro mesi dopo l'iniezione di CCl4. Questo approccio si traduce in oltre il 90% dei topi che sviluppano tumori HCC rispetto ai topi senza esposizione a CCl4. Nel nostro modello, gli epatociti trasferiti dai topi di linea MTD2 ai topi C57BL/6J, il traffico verso il fegato dove vengono incorporati come epatociti che esprimono il TAg come antigene tissutale. L'isolamento degli epatociti da MTD2 è un passaggio critico durante questo protocollo. fegati di topo MTD2 sono perfusi accuratamente con la soluzione 1 e 2 per rimuovere completamente i globuli rossi circolanti all'interno del fegato. La soluzione collagenase viene utilizzata per perfondere il fegato alla concentrazione e alla velocità indicate per generare una corretta digestione del fegato per rilasciare epatociti. L'uso di concentrazioni più basse di collagenasi è insufficiente per la digestione, con conseguente ciuffi di epatociti. Al contrario, le alte concentrazioni sono troppo dure sul tessuto, con conseguente riduzione significativa degli epatociti vitali. Troviamo anche che la breve centrifugazione come descritto nel nostro protocollo è necessaria per migliorare la purezza degli epatociti. Lo spin inferiore che abbiamo usato per la centrifugazione può precipitare gli epatociti e lasciare i leucociti nel supernatante in base alla differenza di densità di questi due tipi di cellule.

Il prossimo passo critico è il percorso per inoculare gli epatociti in topi selvatici. Nei nostri studi pilota, abbiamo esplorato vari modi per condurre l'inoculazione dell'epatocito. Il successo della crescita ortotopica del tumore nel fegato è meglio riscontrata nei topi che ricevono l'inoculazione intrasplenica di epatociti oncogeni a una dose di mezzo milione di cellule per topo, rispetto ai topi che ricevono cellule somministrate tramite vena della coda e intraperitoneali iniezione a varie dosi. Questi risultati suggeriscono che la crescita ortotopica dell'HCC è basata e dipendente dalla dose. La trasformazione maligna avviene gradualmente ed è limitata alla sottopopolazione di epatociti trapiantati piuttosto che all'intero parenchyma epatico. Continua la proliferazione cellulare risultati in noduli tumorali in via di sviluppo in tutto il fegato.

Affinché l'HCC o altri tumori progrediscano, deve eludere il sistema immunitario; infatti, evitare la distruzione immunitaria è ora considerato un segno distintivo del cancro39. Tuttavia, la mancanza di antigene tumorale specifico è una barriera critica per chiarire i meccanismi sottostanti. Nel nostro modello, TAg è espresso nei tumori, non in altri organi, che agisce come un antigene specifico per il tumore. Inoltre, TAg ha numerosi epitopi ben definiti che possono essere riconosciuti dalle cellule T CD8 nei topi C57BL/6J. Per quanto riguarda l'epitopo-I di TAg, abbiamo generato topi di linea 416 che esprimono transgengenicamente i recettori delle cellule T per questo epitopo34. Targeting TAg per esaminare la risposta immunitaria specifica dell'antigene del tumore ci permette di indagare la sorveglianza immunitaria del tumore durante l'inizio e la progressione del tumore, che non è possibile utilizzando modelli indotti da DEN o manipolazione genetica. Chiarire i meccanismi sottostanti ci permette di identificare le cellule critiche e le molecole che mediano la tolleranza immunitaria indotta dal tumore. Il targeting di questi fattori chiave può far progredire significativamente il nostro sviluppo di strategie immunoterapeutiche innovative contro l'HCC. Utilizzando questo modello HCC unico e strumenti consolidati, abbiamo studiato i meccanismi alla base della tolleranza indotta dal tumore25,35 ed esplorato varie immunoterapie antitumorali a base immunitaria31,32 , 36 Mi lasa , 37.

In sintesi, il nostro modello murino stabilito di HCC riflette alcune caratteristiche tipiche della malattia umana. Nel nostro articolo pubblicato in precedenza, siamo stati in grado di stabilire questo come un modello tumorale clinicamente rilevante che aveva caratteristiche tipiche dell'HCC umano. Abbiamo dimostrato che i topi trattati con cCl4 e MTD2 hepatocytes hanno sviluppato tumori che esprimevano antigeni associati all'HCC, AFP e GPC336. La patologia ha determinato che le lesioni nel nostro modello murino sono simili sia macroscopicamente che patologicamente all'HCC umano. Sfruttando questo modello affidabile e gli strumenti sviluppati, possiamo studiare questa complessa malattia umana, tra cui la comprensione dei meccanismi di sviluppo dell'HCC e del trattamento clinicamente disponibile.

Dichiarazioni

Non ce ne sono da dichiarare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è supportato da NIH/NCI R01 CA164335-01A1 (K. F. Staveley-O'Carroll, PI) e NIH/NCI R01CA208396 (Mark Kester, Guangfu Li, Kevin F. Staveley-O'Carroll).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Macchina per anestesiaVETEQUIPIMPAC6macchina per anestesia per chirurgia
Ago a farfallaBD8122963Ago utilizzato per la perfusione epatica
C57BL / 6 topiJackson Lab000664 Topi utilizzati nel prototolo
CarprofeneCRESCENT CHEMICAL20402carprofene per il rilascio del dolore
Cell Strainer CORNINGREF 431751Filtro cellulare, 70µ m, per isolamento di epatociti
CentrifugaBeckman CoulterAllegra X-30Rcentrifuga per isolamento cellulare
Clips Teleflex MedicalREF 523700Clip in Titanio per
Microscopio MilzaZeissPrimovert Microscopio per osservazione cellulare
Topi Mtd2N/ADono del Dr. William A Tenuto presso il Roswell Park Cancer Institute nel 2002, mantenuto nel nostro laboratorio
AgoBDREF 305109Ago BD precisionglide, 27G x 1/2 (0,4 mm x 13 mm)
SuturaETHICONJ303Hsutura VICRYL rivestita
SV40 T Ag anticorpoAbcamab16879anti-SV40 Anti-antigene T per siringa IHC
BDREF 309626Siringa TB da 1 mL per iniezione cellulare
Trypan blueSIGMAT 8154Soluzione di trypan blue per test di vitalità cellulare
Clip per feriteReflexreflex9, Part. No. 201-1000clip per ferite in acciaio inox per chiusura della ferita

Riferimenti

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