ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs の配列決定のためのプロトコルを提示する。
リモートの場所とリソースの優先順位の低い設定では、独自の課題があります。このような状況では、ナノポアシーケンスがうまく利用され、最近のエボラウイルスの流行時に西アフリカに配備され、この可能性を浮き彫りにしました。その実用的な利点 (低コスト、機器の輸送と使用の容易さ) に加えて、この技術はまた、第二世代のシーケンシングアプローチ、特に非常に長い読み取り長、直接配列する能力に勝る基本的な利点を提供しますRNA、およびデータのリアルタイムの可用性。Raw 読み取り精度は、この技術の主な制限を表す他のシーケンスプラットフォームと比べて低くなります。ただし、これは、生成される読み取り深度が高いことによって部分的に軽減されます。ここでは、ebolaviruses の細胞受容体であるニーマンピック C1 の mRNAs エンコーディングのシーケンシングのためのフィールド互換プロトコルを提示します。このプロトコルは、動物の血液サンプルからの RNA の抽出を含み、その後、標的濃縮、バーコード、ライブラリ調製、および配列決定のための RT-PCR が実行され、他の DNA または RNA 標的との使用に容易に適合することができる。
シーケンシングは、生物学的および生物医学的研究において強力で重要なツールです。ゲノム、遺伝的変異、RNA 発現プロファイルの解析が可能となり、ヒトや動物の疾患の調査においても重要な役割を果たしています (1,2)。サンガーシーケンシングは、DNA シーケンシングに利用可能な最も古い方法の1つであり、今日でも日常的に使用されており、分子生物学のコーナーストーンとなっています。過去50年にわたって、この技術は 1000 nt 以上の読み取り長と 99.999%1の高精度を達成するために改善されました。しかし、サンガーシーケンシングにも限界があります。この方法でより大きなサンプルセットまたはゲノム全体の分析をシーケンシングするには、時間がかかり、コストが1,3です。454 pyrosequencing やイルミナテクノロジーなどの第二世代 (次世代型) の DNA シーケンシング手法により、過去10年間での順序付けに必要なコストと作業負荷を大幅に削減でき、その結果、利用可能な生物学的配列情報の量4.それにもかかわらず、これらの第二世代技術を使用して実行される個々のシーケンスは高価であり、必要な機器がかさばると壊れやすい (サンガーシーケンシングデバイスに似ている) ため、フィールド条件下でのシーケンシングは困難であり、多くの場合特別な訓練を受けた人員によって目盛りが付き、修理される。また、第二世代技術の多くは読み取り長がかなり限られているため、これらのデータの下流のバイオインフォマティクス解析が困難になることがよくあります。
ポケットサイズのナノポアシーケンスデバイス (「材料表」を参照) を使用した第3世代のシーケンシングは、これらの確立されたシーケンスプラットフォームの代替手段として役立ちます。これらのデバイスでは、一本鎖 DNA または RNA 分子が、センサーによって測定されるイオン電流と同時にナノポアを通過します (図 1)。ストランドがナノポアを横断するにつれて、任意の所与の時点において細孔に存在するヌクレオチドによる電流の変調が検出され、そしてヌクレオチド配列5へと計算的に後方翻訳される。この動作原理のため、ナノポアシーケンシングでは、非常に長い読み取り (1 x 106ヌクレオチド6に近い) の生成と、リアルタイムでのシーケンシング・データの分析の両方が可能になります。バーコードは、試料中の核酸に定義されたヌクレオチド配列を付着させることによって可能であり、これにより単一の配列決定の実行で複数のサンプルの分析が可能になり、サンプルのスループットが向上し、サンプルコストが低下します。高い可搬性と使いやすさにより、東アフリカにおける最近のエボラウイルス疾患の流行において現場で使用されてきたナノポアシーケンシング装置は、遠隔地への迅速な展開への適合性を強調する7,8.
ここでは、ebolaviruses などの filoviruses のための偏性エントリ受容体であるニーマン・ピック C1 (NPC1) タンパク質の mRNA エンコーディングのシーケンシングのための詳細なフィールド互換プロトコルについて説明し、種の感受性を制限することが示されています。これらのウイルス9,10.このプロトコルは、血液サンプルからの全 RNA の抽出、RT-PCR による NPC1 mRNA の特異的増幅、サンプルのバーコード、ライブラリ調製およびナノポア配列決定装置によるシーケンシングを包含する。データ分析はスペースの制限のために議論することができませんが、いくつかの基本的な方向は代表結果で提供されます。しかし、興味のある読者は、我々が使用したワークフローのより詳細な説明のために、以前のパブリケーション11と呼ばれ、他の人によっての出版物について詳細な情報を求めて12、13、14このワークフローで使用する解析ツールについて。
過去20年間にわたって、生物学的サンプルのシーケンシングは、広範囲の対象分野における研究のますます重要な側面となっている。酵素操作と画像ベースのデータ取得の反復サイクルを使用した DNA 特徴の密配列のシーケンスに基づく第二世代シーケンシングシステムの開発により、スループットが大幅に向上した。従来のサンガーシーケンシング技術は、所与のサンプル中の様々な核酸種と同様に複数のサンプルを並列4で分析することを可能にする。ただし、一般的に使用される第二世代システムのほとんどでは、短い読み取りのみが生成され、すべてのプラットフォームは、高感度でかさばる、高価な装置3,4に依存しています。
第二世代のシーケンスプラットフォームとは対照的に、このプロトコルで使用されるシーケンスデバイスはナノポア技術に基づいています。ここで一本鎖核酸分子はナノポアを通過し、同じナノポアを通って流れているイオン電流の変調をもたらし、そしてこれを測定して、その核酸分子の配列を推論するために再翻訳することができる。この第3世代のシーケンシング・アプローチは、他のアプローチよりも多くの利点を与えます。この技術の独特な動作原理に直接関係している主な利点は、生成された非常に長い読み取り長 (8.8 x 105ヌクレオチドまでの読み取り長は6)、DNA だけでなく、配列する能力であるまた、最近では完全なインフルエンザウイルスゲノム17について実証された RNA を直接、生成されているようにリアルタイムでデータを分析する能力を有しており、これにより、数分以内に病原体の迅速なメタゲノミクス検出が可能になる。追加の実用的な利点は、ナノポアシーケンスデバイスの非常に小さいサイズであり、任意の実験室またはフィールドミッションで、遠隔地19、20、および他のシーケンスと比較して低価格での使用を可能にするプラットフォーム。ランニングコストの面では、現在、新しいフローセルが各シーケンシング実行に必要とされ、その結果、フローセルとライブラリ調製試薬の実行あたり約 $1100 のコストが発生します。これらのコストは、フローセルを洗浄して再利用するか、または1回の実行で複数のサンプルをバーコードして順序を決定することによって減少する場合があります。また、新しいタイプのフローセルは、現在、フローセルアダプタ (「flongle」と呼ばれる) の使用を必要とする少数の実験室によってベータテストされており、フローセル価格を大幅に削減し、したがってコストを実行する必要があります。
ナノポアシーケンシングの主な欠点は、83の範囲での単一の読み取り精度と、6、21、22と報告されている 86% の精度、および挿入/削除によって引き起こされる不正確さの大部分が、その正確性を維持します (欠損)5,21.しかし、高い読み取り深度はこれらの不正確さを補うことができ、最近の研究は、> 10 の読み取り深度が > 99.8%21に全体的な精度を高めるかもしれないという理論的考察に基づいて提案しました。それにもかかわらず、コンセンサスシーケンスレベルではなく単一の分子レベルで解析を実行する場合は特に、精度のさらなる向上が必要になります。このプロトコルに記述されている 1D2技術の使用は、1つの DNA 分子の両方の鎖が同じナノポアによって配列される結果となる 1d2およびバーコードアダプタ (cf. セクション 5.5) の追加に基づいて、読み取りを増加両方の DNA 鎖からの情報は、配列決定のために使用することができるので、精度。さらに、ナノポアシーケンシングの利点 (特に長い読み出し長) と他のシーケンシング技術の高い精度とを組み合わせるために追求できる回避戦略は、足場としてナノポアシーケンシング情報を使用することです。その後、他のプラットフォーム6からのシーケンスデータを用いて研磨する。
ここで示されたプロトコルの成功のための最も重要な要因は、サンプル品質、特に抽出された RNA の量および質である。十分な RNA の収穫を達成するために RNA の助けの適切で貯蔵そして敏速な抽出。適切な採血チューブを使用することにより、最大1ヶ月間血液サンプルを保存することができますが、特にサンプルが高温で保存されている場合、フィールド条件下で発生する可能性があるため、血液凝固は問題になる可能性があります。第2の重要なステップは、標的配列の増幅であり、そして特定のフィールド条件下での PCR 反応は、通常、標準的な実験室条件7の下ではあまりよく行われない。このため、堅牢な増幅を実現するには、慎重にプライマーの設計と最適化を行うことが重要です。さらに、このプロトコルで使用される入れ子になった pcr のアプローチとタッチダウン pcr は、標的遺伝子増幅4,7の特異性と感度の両方を高めることができます。実際に、リベリアとギニアでの経験では、この技術とネストされたプロトコルは、実験室サンプルからのターゲットの増幅を可能にし、実験室条件下でのプライマーセットのためにもフィールドサンプルとフィールド条件の下で必要でした1ラウンドの PCR (7と未発表の結果)。
これらのより重要なステップとは対照的に、ライブラリの準備とシーケンスの実行自体はかなり堅牢な手順です。しかし、フィールド条件下では、機器の特定の部分の可用性などの実用的な問題が問題になることができます。たとえば、バーコードサンプルのライブラリー調製前に、DNA 濃度を決定するために UV 分光光度計が必要です。しかし、そのようなデバイスがフィールド条件下で利用可能でない場合は、サンプル入力材料の違いにより、各サンプルの等しい容積を単純に組み合わせて、ライブラリの準備に必要な45μ l を構成することができ、通常は大読み取りの数。同様に、ベースコールをオンラインで実行する必要はなく、ローカルで実行できる場合でも、シーケンス実行のためのインターネット接続の必要性は問題になる可能性があります。しかし、必要に応じて、この必要性は、製造業者によって特定の状況下で除去することができます。
要約すると、提示されたプロトコルは、従来のシーケンス機器 (遠隔地など) にアクセスできない場所で比較的低コストのシーケンシングを可能にします。それはあらゆるターゲット RNA または DNA に容易に合わせることができ、こうして研究者が多数の生物学的な質問に答えることを可能にする。
The authors have nothing to disclose.
著者は、原稿の批判的な読解のためのアリソン Groseth に感謝します。この作品は、ドイツ連邦農業・食糧省 (BLE) によるドイツ連邦議会の決定に基づいて BMEL によって財政的支援を受けました。
1D2 adapter, barcode adapter mix, ABB buffer, elution buffer, RBF buffer, LBB beads | Oxford Nanopore Technologies | SQK-LSK308 | 1D² Sequencing Kit |
blood collection tube with DNA/RNA stabilizing reagent | Zymo Research | R1150 | DNA/RNA Shield – Blood Collection Tube |
blunt/TA ligase master mix | New England Biolabs | M0367S | Blunt/TA Ligase Master Mix |
DNA-low binding reaction tube | Eppendorf | 30108051 | DNA LoBind Tube |
DNase buffer and DNase | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
flow cell | Oxford Nanopore Technologies | FLO-MIN105.24 | flow cell R9.4 |
hot start high fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0493L | Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase (500 U) |
magnetic beads | Beckman Coulter | A63881 | Agencourt AMPure XP beads |
magnetic rack | ThermoFisher Scientific | 12321D | DynaMag-2 Magnet |
nanopore sequencing device | Oxford Nanopore Technologies | – | MinION Mk 1B |
PCR barcoding kit | Oxford Nanopore Technologies | EXP-PBC001 | PCR Barcoding Kit I (R9) |
reverse transcriptase master mix | ThermoFisher Scientific | 11766050 | SuperScript™ IV VILO™ Master Mix with ezDNase™ Enzyme |
RNA purification spin column, DNA/RNA prep buffer, DNA/RNA wash buffer, DNase I, DNA digestion buffer | Zymo Research | R1151 | Quick-DNA/RNA Blood Tube Kit |
rotating mixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | HulaMixer Sample Mixer |
Taq DNA polymerase | New England Biolabs | M0287S | LongAmp Taq 2X Master Mix |
Ultra II End-prep kit | New England Biolabs | E7546S | NEBNext Ultra II End-Repair/dA-tailing Modul |
UV spectrophotometer | Implen | – | NanoPhotometer |
vacuum manifold | Zymo Research | S7000 | EZ-Vac Vacuum Manifold |