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Biochemistry

Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal

Published: July 25, 2019 doi: 10.3791/59385
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 1,2
1Maisonneuve-Rosemont Hospital Research Center and Department of Medicine, University of Montréal, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Sinai Health System
* These authors contributed equally

Summary

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em processos celulares e é fortemente coordenada pela deubiquitinação. Os defeitos em ambas as reações fundamentam patologias humanas. Nós fornecemos protocolos para a realização de ubiquitinação e reação de deubiquitinação in vitro usando componentes purificados.

Abstract

A ubiquitinação é uma modificação pós-translacional que desempenha papéis importantes em várias vias de sinalização e é notavelmente envolvida na coordenação da função de cromatina e processos associados ao DNA. Esta modificação envolve uma ação seqüencial de diversas enzimas que incluem E1 ubiquitin-ativando, E2 ubiquitina-conjugating e E3 ubiquitina-ligase e é revertida por deubiquitinases (DUBs). A ubiquitinação induz a degradação de proteínas ou alteração da função protéica, incluindo modulação da atividade enzimática, interação proteína-proteína e localização subcelular. Uma etapa crítica em demonstrar a ubiquitinação da proteína ou o deubiquitination é executar in vitro reações com componentes purified. As reações eficazes do ubiquitinação e do deubiquitination podiam extremamente ser impactadas pelos componentes diferentes usados, pelos cofactores da enzima, pelas condições do amortecedor, e pela natureza do substrato.  Aqui, nós fornecemos protocolos passo a passo para a realização de reações de ubiquitinação e deubiquitinação. Nós ilustramos estas reações usando componentes mínimos do rato polycomb repressive complexo 1 (PRC1), BMI1, e RING1B, uma ligase de ubiquitina E3 que monoubiquitinates histona H2A em lisina 119. A deubiquitinação da H2A nucleossomal é realizada por meio de um complexo mínimo de Policomb repressivo Deubiquitinase (PR-DUB) formado pelo deubiquitinase humano BAP1 e pelo domínio do adaptador DEUBiquitinase (DEUBAD) de seu fator ASXL2. Esses ensaios de ubiquitinação/deubiquitinação podem ser conduzidos no contexto de nucleossomas recombinantes reconstituídos com proteínas purificadas por bactérias ou nucleossomas nativos purificados de células de mamíferos. Destacamos as complexidades que podem ter um impacto significativo sobre essas reações e propomos que os princípios gerais desses protocolos possam ser rapidamente adaptados a outras ligases e deubiquitinases de ubiquitina da E3.

Introduction

A ubiquitinação é uma das modificações pós-translacionais mais conservadas e é fundamental para uma grande variedade de organismos, incluindo leveduras, plantas e vertebrados. A ubiquitinação consiste na fixação covalente da ubiquitina, um polipeptídeo de aminoácido 76 altamente conservado, para direcionar proteínas e ocorre em três etapas sequenciais envolvendo três enzimas, ou seja, E1-ativando, E2-conjugating e E3 ligase1, 2,3. Esta modificação pós-translacional desempenha papéis centrais em um amplo espectro de processos biológicos. De fato, as ligases da E3, que proporcionam a especificidade da reação, constituem uma grande superfamília de enzimas e são as enzimas mais abundantes do sistema de ubiquitina4,5,6. Os efeitos a jusante do ubiquitinação da proteína dependem da natureza da modificação: monoubiquitination, multimonoubiquitination, e polyubiquitination linear ou ramificado. O monoubiquitination é associado raramente com a degradação degradação, mas preferivelmente esta modificação é envolvida em mediar vários eventos de sinalização. A poliubiquitinação envolve o N-terminal ou os resíduos de lisina na própria molécula de ubiquitina, e o destino de uma proteína policuquitinada depende de qual resíduo está envolvido na extensão da cadeia de ubiquitina. Há muito se sabe que a poliubiquitinação mediada pela lisina 48 de ubiquitina induz a degradação degradação. Pelo contrário, a poliubiquitinação via lisina 63 da ubiquitina é frequentemente associada à ativação proteica7,8,9. Semelhante a outras importantes modificações pós-translacionais, a ubiquitinação é reversível e a remoção de ubiquitina de proteínas é assegurada por proteases específicas denominadas deubiquitinases (DUBs), que surgiram como importantes reguladores dos processos celulares 2. º , 10. importante, muitos dubs são altamente especializados, e regulam, através deubiquitinação, substratos específicos, indicando que um equilíbrio fino entre ubiquitinação e deubiquitinação é crítico para a função protéica. E3s e dubs, junto com a maquinaria da degradação do Proteassoma e os fatores acessórios, formam o sistema do Proteassoma de ubiquitin (UPS, com > 1200 genes) que regula as vias de sinalização principais, diversas de que são associadas com o crescimento e a proliferação da pilha, determinação de destino celular, diferenciação, migração celular e morte celular. É importante ressaltar que a desregulação de várias cascatas de sinalização envolvendo a ubiquitinação promove atumorigênese e as doenças neurodegeneradas5,11,12,13, a 14.

A ubiquitinação desempenha papéis penetrantes na biologia da cromatinae nos processos dependentes de DNA15,16,17. Por exemplo, a monoubiquitinação da histona H2A em lisina 119 (doravante H2A K119ub) é uma modificação crítica pós-translacional envolvida na repressão transcricional e no reparo do DNA18,19,20, 21,22. H2A K119ub é catalisada pelo complexo repressivo Polycomb 1 (PRC1), que desempenha um papel fundamental na manutenção da informação epigenética e é altamente conservado da Drosophila para o ser humano. O PRC1 canônico é constituído, notavelmente, pelos RING1B e BMI1, que são o núcleo do complexo de ligase da ubiquitina E3, responsável pelo evento de ubiquitinação22,23. Na Drosophila, a monoubiquitinação H2A (H2A K118ub que corresponde a H2A K119ub em mammalianos) é revertida pelo Dub Calypso, que interage com o adicional sexo Comb (ASX) formando o polycomb-REPRESSIVE Dub (PR-Dub) complexo24. O ortólogo de mamíferos de Calypso, BAP1, é um supressor de tumor suprimido ou inativado em várias malignidadeshumanas 25,26,27,28, 29. º , 30 anos de , 31 de dezembro , 32 , 33. BAP1 regula os processos dependentes de DNA no núcleo e apoptose mediada por sinalização de cálcio no retículo endoplasmático33,34,35,36, 37 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42. BAP1 monta complexos proteicos multisubunitários contendo reguladores de transcrição notavelmente ASXL1, ASXL2 e ASXL3 (asxls), três ortologues de ASX38,43. Asxls use o domínio do adaptador deubiquitinase (deubad), também denominado domínio asxm, para estimular BAP1 atividade Dub35,36,44. Assim, ASXLs desempenham papéis importantes na coordenação da atividade BAP1 DUB na cromatina e, mais amplamente, sua função supressor tumoral.

Existem vários métodos para estudar os processos de ubiquitinação e deubiquitinação. Notavelmente, os ensaios bioquímicos usando proteínas purificadas de bactérias permanecem muito poderosos na demonstração de ubiquitinação direta ou remoção de ubiquitina de substratos específicos. Esses experimentos podem ser conduzidos para investigar uma série de parâmetros como determinar a exigência de complexos mínimos, determinar a cinética de reações, definir relações estrutura/função e compreender o impacto da patologia patológica mutações genéticas. Aqui, nós fornecemos protocolos para realizar reações de ubiquitinação e deubiquitinação em substratos de cromatina com componentes purificados. Como um sistema modelo, o ubiquitinação in vitro e o deubiquitination da proteína H2A o são apresentados. As proteínas bactérias-purificadas montadas em complexos mínimos de RING1B/BMI1 e BAP1/DEUBAD são usadas para ubiquitinação ou deubiquitinação de H2A nucleossomal, respectivamente.

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Protocol

1. GSH-agarose afinidade purificação do GST-RING1B (1-159)-BMI1 (1-109) E3 ubiquitin ligase Complex

  1. Use a construção de expressão de bactérias pGEX6p2rbs-GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109aa) para transformar bactérias BL21 (DE3) (ver tabela de materiais)23. Esta construção permite a expressão do domínio RING1B murino 1-159 fundido ao domínio BMI1 1-109 com tag de GST no backbone de pGEX-6P-2.
  2. Realize uma cultura de início noturno inoculando RIL-bactérias expressando GST-RING1B (1-159 AA)-BMI1 (1-109 AA) em 20 mL de caldo LB na presença de 100 μg/mL de ampicilina e 50 μg/mL de cloranfenicol. Incubar agitando a 37 ° c durante a noite. No dia seguinte, adicione a cultura de arranque a um balão de 1 L contendo 500 mL de caldo fresco LB (1/26 diluição) com ampicilina e incubar a cultura na coqueteleira a 37 ° c durante 2 a 4 h.
  3. Durante o tempo de incubação, medir o OD em 600 nm com um espectrofotômetro. Quando a cultura de bactérias atinge 0,6 unidades de OD a 600 nm, tome uma alíquota de 1 mL em um tubo de 1,5 mL como a amostra não induzida. Adicionar 400 μM de isopropílico β-D-1-tiogalactopyranoside (IPTG) à cultura 1 L para induzir a expressão protéica. Incubar bactérias a 25 ° c por 6 h para a noite.
    1. Centrifugue as alíquotas de 1 mL em 14.000 x g por 30 s, descarte o sobrenadante, resuma a pelota em 200 μL de tampão da amostra de Laemmli, e mantenha para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul da indução da proteína.
  4. Transfira a cultura de bactérias induzidas do balão para uma garrafa de centrifugação limpa e gire para baixo a 3.500 x g durante 15 min a 4 ° c. Descarte o sobrenadante e ressuscita o pellet com 40 mL de PBS frio e gire para baixo a 3.500 x g por 15 min a 4 ° c.
  5. Descarte o sobrenadante e congele o pellet em-80 ° c ou prossiga para a próxima etapa. Se as proteínas forem induzidas com o peso molecular esperado, avance para o passo seguinte.
  6. Ressuscita as bactérias pellet em 25 mL de gelo-frio lise tampão a (50 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm NaCl, 1 mm EDTA, 1% NP40, 1 mm pmsf, 0,5 mm DTT, e 1/100 anti-protease cocktail contendo AEBSF, aprotinina, Bestatina, e-64, Leupeptina, e Pepstatin A). Certifique-se de que todas as bactérias pellet é ressuscipended. O PMSF e o coquetel antiprotease devem ser recém-adicionados ao tampão de Lise, apenas no momento da lise das bactérias.
    Atenção: Mantenha sempre a amostra no gelo.
    Nota: Lysozyme em 100 μg/mL pode ser adicionado para aumentar a Lise das bactérias.
  7. Incubar o lisado de bactérias no gelo por 15 min. Use um sonicador de sonda e proceda em 70% de amplitude de saída para 30 s (4 – 5x) e, em seguida, centrifugue a 21.000 x g por 20 min a 4 ° c.
    Atenção: Durante a sonicação, mantenha sempre as amostras no gelo.
  8. Durante o tempo de centrifugação, tomar 500 μL embalado GSH-agarose grânulos (50% chorume) em um tubo de 15 mL e adicionar 10 mL de tampão a sem PMSF e anti-proteases. Misture brevemente e gire a 2.500 g por 3 min a 4 ° c, repita este passo de lavagem mais duas vezes e mantenha as contas no gelo.
  9. Após a centrifugação bacteriana do lisado, colete o sobrenadante e transfira-o em um tubo cónico de 50 ml. Tome uma alíquota de 100 μL como um lisado total e adicione 100 μL do amortecedor da amostra de 2x Laemmli para a análise do azul de SDS-PAGE e de Coomassie.
  10. Filtre o lisado através do filtro da seringa do pore de 0,45 μm e misture-o com os grânulos de GSH. Incubar a 4 ° c com agitação por 5 h. Gire para baixo os grânulos em 2.500 x g por 3 minutos, remova, e excepto o sobrenadante como o fluxo completamente. Lave as esferas ligadas às proteínas-GSH 6 vezes (5 mL cada) com o tampão a contendo o cocktail antiprotease e o PMSF.
  11. Após a última lavagem, transfira as contas juntamente com 10 mL de tampão em uma coluna de cromatografia vazia, adicione 1,5 mL de tampão a contendo 25 mm de glutationa, e colete a eluição por gravidade em 1,5 ml de microtubos. Repita o procedimento de eluição 4 vezes.
    Nota: A solução em estoque de glutationa é preparada a 200 mM de concentração em 50 mM Tris-HCl, pH 7,5
  12. Tome uma alíquota de 10 μL de cada uma das 4 eluições e adicione 10 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli. Estas amostras serão usadas para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul para determinar a presença e a pureza das proteínas purificadas.
    Nota: Após a última eluição, manter as contas em buffer a 4 ° c para reciclagem e uso futuro.
  13. Escolha as frações eluidas que mostram quantidades razoáveis de proteínas purificadas para uma análise mais aprofundada. Faça pequenas alíquotas da preparação. Armazene as proteínas purificadas em-80 ° c. Normalmente, a concentração proteica irá variar de 0,5 μg a 2 μg por μL e as amostras podem ser armazenadas neste estado.
  14. Opcional: Concentre a amostra ou altere o buffer usando uma unidade de filtro centrífugo 10K

2. purificação do complexo de Deubiquitinase BAP1/DEUBAD (ASXL2)

  1. Use pET30a +-his-BAP138 e PDEST-MBP-DEUBAD (ASXL2)35 construções bacterianas da expressão para transformar BL21 (de3) bactérias RIL para a produção de his-BAP1 e de MBP-deubad respectivamente.
  2. Realize duas culturas de partida durante a noite separadas incubando his-BAP1 e MBP-DEUBAD (ASXL2) expressando bactérias em 20 ml de caldo lb de meio de ampicilina contendo 50 μg/ml de cloranfenicol e o antibiótico correspondente para cada plasmídeo, 100 μg/ mL de canamicina ou 100 μg/mL de ampicilina, respetivamente. Coloque na coqueteleira a 37 ° c.
  3. Execute as etapas 1.3 – 1.6.
  4. Ressuscita as pelotas de bactérias em 25 mL de tampão de Lise gelo-frio B (50 mM TRIS pH 7,3, 500 mM NaCl, 3 mM β-Mercaptoetanol, 0,2% Triton X-100, 1 mM PMSF e 1/100 anti-protease cocktail). Misture volumes iguais do his-BAP1 com os lisados de MBP-DEUBAD e incubar no gelo por 15 min. SONICATE e depois centrifugar o lisado como indicado no protocolo 1 (passo 9).
    1. Durante a centrifugação, prepare 500 μL de grânulos de agarose de NI-NTA (50% de chorume) lavando-os três vezes com tampão B sem PMSF e coquetel antiprotease.
  5. Após a centrifugação bacteriana do lisado, colete o sobrenadante e transfira-o em um tubo cónico de 50 ml. Tome uma alíquota de 100 μL como um lisado total e adicione 100 μL do amortecedor da amostra de 2x Laemmli para a análise do azul de SDS-PAGE e de Coomassie.
  6. Filtre o lisado através do filtro de seringa de poros de 0,45 μm e misture-o com os grânulos NI-NTA. Incubar a 4 ° c com agitação por 5 h. Gire para baixo os grânulos em 2.500 x g por 3 minutos, remova, e excepto o sobrenadante como o fluxo completamente.
    1. Lave os grânulos 6 vezes (5 mL cada) com tampão B contendo 20 mm 1,3-diaza-2,4-ciclopentadieno (imidazol).
      Nota: fazer uma solução de estoque de 2 M imidazol em pH 7,3.
  7. Após a última lavagem, transfira os grânulos com 10 mL de tampão para uma coluna de cromatografia vazia, adicione 1 mL de tampão B contendo 200 mm de imidazol e colete a eluição por gravidade em microtubos de 1,5 ml contendo 10 ΜL de dtt (500 mm) e 2 ΜL de EDTA (500 mm , pH: 8). Repita o procedimento de eluição 4 vezes. Tome 10 μL de cada fração de eluição e adicione 10 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli para análise de SDS-PAGE e de azul de Coomassie. Pool as frações eluída desejadas.
    Nota: Mantenha as contas em buffer a 4 ° c para reciclagem e uso futuro.
  8. Diluir o complexo eluído 3 vezes com tampão C (50 mM TRIS pH 7,3, 300 mM NaCl, 1% Triton X-100, 5 mM DTT, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF e 1/100 inibidor de protease cocktail) antes da incubação com os grânulos de agarose de amilose.
    1. Prepare grânulos de agarose de amilose (500 μL embalados) lavando-os 2 vezes com o tampão C sem adicionar PMSF e coquetel antiprotease. Adicionar os grânulos à eluição diluída e incubar durante a noite a 4 ° c.
  9. Centrifugador em 2.500 x g por 3 minutos e mantenha o fluxo completamente. Lave as esferas de proteínas-limites com 5 mL de tampão C (5 – 6x).
  10. Mantenha o complexo purificado his-BAP1/MBP-deubad nos grânulos do Agarose do amilose no tampão D (50 milímetros HEPES pH 8,0, 50 milímetros NaCl, 10% glicerol, e 1 milímetro DTT) e armazene em-80 ° c. Tome 20 μL da fração de grânulos (50% de solução de grânulos) e adicione 20 μL de tampão de amostra de 2x Laemmli para a análise de SDS-PAGE e de azul de Coomassie.

3. purificação dos Nucleosomos de células HEK293T

  1. Cultura HEK293T células em completo Dulbecco ' s modificado Eagle ' s médio (DMEM) suplementado com 5% recém-nascido bezerro soro (NBS), 2 mM L-glutamina, e 1% penicilina/estreptomicina.
  2. Placa em torno de 12 x 106 HEK293T células em 20 ml de mídia completa por prato de cultura de 15 cm um dia antes do transfection (10 pratos foram usados). Antes do transfection, mude o meio da pilha a 12 ml do meio soro-livre e transfecção as pilhas com 21 μg de pcdna-Flag-H2A usando 63 μl do tais (PEI) em 1 mg/ml36. Mude para o meio completo 12 h mais tarde.
  3. Três dias após a transfecção, lave as células com 15 mL de PBS gelado (duas vezes) e colá-las em 3 mL de PBS gelada usando um raspador de células. Centrifugador a 2.100 x g durante 8 min a 4 ° c. Descarte o PBS e prossiga para a etapa de Lise ou congele o pellet celular em-80 ° c.
  4. Ressuscita o pellet celular em cerca de 10 volumes de buffer e (50 mm Tris-HCl pH 7,3, 420 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm MgCl2, 1 mm PMSF, 1/100 inibidor de protease cocktail, e 20 mm de N-METILMALEIMIDA (nem)) e incubar no gelo por 20 min. adicionando N-methylmaleimide (NEM) é crítico para inibir DUBs que copurify com nucleosomes.
  5. Após a centrifugação em 3.000 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuscitem a pelota da cromatina em 10 volumes de tampão e. misture por inversão e centrifugador em 3.000 x g por 5 min.
    1. Repita a etapa de lavagem outra vez usando buffer e e duas vezes usando buffer F "mnase buffer" (20 mm Tris-HCl pH 7,5, 100 mm KCl, 2 mm MgCl2, 1 mm CAcl2, 0,3 M de sacarose, 0,1% NP-40, 1 mm PMSF, e 1/100 inibidor de protease cocktail).
      Cuidado: o pellet flutuará durante as lavas e centrifugação.
  6. Suspender a cromatina em tampão F de 5 ml e tratar a pelota com nuclease Micrococcal (mnase) (3 U/ml por 10 min à temperatura ambiente).
    Nota: A reação pode ser auxiliada pela mistura usando um homogeneizador dounce.
  7. Após a incubação, tomar uma alíquota de 40 μL da mistura para análise de fragmentos de DNA nucleossomal. Misture esta alíquota com 40 μL de fenol/clorofórmio e 20 μL de tampão de carregamento de ADN 6x, vortex, gire a 18.000 x g durante 2 min e carregue o ADN num gel de agarose a 2%.
    1. Quando o DNA é predominantemente um fragmento de 147 BP correspondente a mononucleossomas, pare a reação adicionando EDTA de 5 mM na concentração final.
  8. Após a centrifugação a 21.000 x g durante 20 min a 4 ° c, incubar a fração de cromatina solúvel com resina anti-Flag durante a noite a 4 ° c. Lave as contas com 6x tampão G (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 5 mm EDTA, 150 mm NaCl, 1% NP-40, 1 mm PMSF, 1 mm dtt, 1/100 inibidores da protease cocktail).
  9. Transfira as contas com 5 mL de tampão G para uma coluna de cromatografia vazia. Elute os nucleossomos grânulos-limitados com 200 μg/ml do peptide da eluição da bandeira. Utilize um tampão de eluição composto por tampão G contendo 200 μg/ml peptídeos de eluição de sinalizador (ver tabela de materiais) e 1/5 (vol: Vol) 1 M Tris, pH 8,0. Elute os nucleossomos 3x com 260 μl tampão da eluição da bandeira (2 h cada eluição).
  10. Teste as 3 eluições tomando uma alíquota para a extração do fenol-clorofórmio e carregue o ADN em um gel do agarose de 2%. Tome 10 μL de cada fração de eluição e adicione 10 μL de tampão de amostra de Laemmli 2x para a análise de SDS-PAGE e de Coomassie azul e carregue cada eluição para a deteção ocidental do borrão de H2A. Armazene a eluição em-80 ° c. Em geral, a purificação de células humanas produz menos quantidade de proteínas do que a das bactérias, com concentrações variando de 0,1 a 0,5 μg/μL.

4. nucleosome Ubiquitinação ensaio usando BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase Complex

  1. Centrifugue os nucleosomos através dos filtros centrífugos do pore 0,5 mL de 10K para mudar o substrato do amortecedor da eluição ao amortecedor H da reação (25 milímetros Tris, pH 7,5; 10 milímetros MgCl2, e 5 milímetros ATP). Alternativamente, os nucleossomos disponíveis comercialmente podem ser usados para o ensaio.
    Nota: A alteração da solução de suspensão do substrato para o tampão de reação assegura a reprodutibilidade e previne a potencial inibição da ligase E3 por compostos presentes na mistura de eluição da bandeira.
  2. Incubar 1 μg dos nucleossomas em 40 μL de volume total de tampão H. Adicione o UB ativando enzyme (UBE1) (250 NG), UB (50 ng/μL) e E2 UB-conjugating enzimas (672 NG), e 1 μg de BMI1/RING1B E3 ubiquitin ligase complexo. Incubar a reacção durante 3 h a 37 ° c com agitação ocasional.
    Nota: Vários controles podem ser conduzidos em paralelo, incluindo omitindo, E1, E2, E3, ATP e ubiquitina. Isto assegura a especificidade para a reação do ubiquitinação.
  3. Pare a reação adicionando 40 μl do amortecedor da amostra de 2x Laemmli e analise o histona H2A K119 ubiquitinação por SDS-PAGE e por blotting ocidental, de acordo com procedimentos padrão. Use anticorpos anti-H2A ou H2A K119ub (ver tabela de materiais).

5. in vitro Nucleossomal H2A ensaio DUB usando BAP1/DEUBAD

  1. Utilize os nucleossomas purificados para o ensaio de deubiquitinação in vitro. Ressuscita 100 – 500 ng de nucleossomas em 40 μL de tampão I (50 mm Tris-HCl, pH 7,3, 1 mm MgCl2, 50 mm NACL e 1 mm DTT). Adicionar 1 μg de BAP1 bactérias-purificada his-BAP1 e MBP-DEUBAD. Realize a reação de deubiquitinação por 3 h a 37 ° c com agitação ocasional.
  2. Pare a reacção in vitro adicionando 40 μL de 2x tampão de Laemmli e analise por immunoblotting.

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Representative Results

As proteínas GST-BMI1 e RING1B são bem produzidas em bactérias e podem ser prontamente extraídas na fração solúvel. A Figura 1a mostra uma coloração azul Coomassie para uma purificação típica do complexo GST-BMI1-RING1B. As bandas GST-BMI1 e RING1B migram para o peso molecular esperado, ~ 45 kDa e ~ 13 kDa, respectivamente. Notavelmente o complexo de ligase E3 é altamente homogêneo, com níveis muito baixos de proteínas de bactérias contaminantes e/ou produtos de degradação. Além disso, a estequiometria do complexo purificado é ótima, como com uma relação molar de 1:1, a intensidade da banda da proteína GST-RING1B deve ser duas a três vezes mais forte do que a de BMI1. Da mesma forma, a purificação do complexo his-BAP1/MBP-DEUBAD também resultou em preparações relativamente altamente homogêneas com bandas em ~ 90 kDa e ~ 55 kDa, respectivamente (Figura 1b). A purificação em tandem da afinidade de BAP1 e de deubad, com o níquel-agarose e o amylose-agarose assegura respectivamente e o estequiometria adequado e a remoção de BAP1 livre do complexo purified. Por outro lado, a fração nucleossomal purificada é composta essencialmente por faixa de 147bp, indicando a presença de fração mononucleosomal altamente enriquecida (Figura 1C). A coloração do azul de Coomassie destes nucleossomos purificados mostra um teste padrão típico da faixa das quatro subunidades do histona com quantidades estequiométrica (Figura 1D). Os mononucleosomes de recombinação comercialmente disponíveis igualmente exibem testes padrões similares da proteína e do ADN quando migrados em géis da SDS-página e do agarose respectivamente. De notar, as formas monoubiquitinadas de H2A e Flag-H2A podem ser prontamente distinguidas em nucleossomas HEK293T purificados. Nós usamos nucleossomos de recombinação junto com E1/E2/ubiquitin/ATP e observamos que o ubiquitinação do H2A do histona com o complexo BMI1-RING1B mostra um aumento tempo-dependente do formulário ubiquitinizadas da proteína, quando os níveis da forma não-modificada forem concomitantemente diminuiu. A reação de ubiquitinação é total, pois praticamente todas as proteínas H2A são transformadas em H2A K119ub (Figura 1e). Por outro lado, o ensaio de deubiquitinação foi conduzido em nucleossomas nativos. Após a incubação desses nucleossomas com BAP1/DEUBAD, observou-se redução do tempo-dependente do sinal de H2A K119ub (Figura 1F). Note-se que duas bandas de H2A ubiquitinizadas observado com H2A K119ub correspondem a transfected Flag-H2A e H2A endógena migrando em ~ 30 kDa e ~ 25 bandas kDa respectivamente.

Figure 1
Figura 1: purificação, ubiquitinação e deubiquitinação. (A) purificação de proteínas e análises de GST-RING1B-BMI1 utilizando coloração azul Coomassie. GST-RING1B-BMI1 foram produzidos em bactérias e purificados usando contas de afinidade GST. Para confirmar a pureza da purificação e o tamanho das proteínas, as elutions foram carregadas no gel de SDS-PAGE de 15% e manchadas com o azul de Coomassie. A quantidade diferente de BSA é usada para determinar a quantidade da proteína. O gel manchado foi escaneado para gerar a figura. (B) purificação do complexo MBP-deubad/his-BAP1. MBP-DEUBAD e HIS-BAP1 foram produzidos separadamente em bactérias. Após Lise, MBP-DEUBAD e HIS-BAP1 foram misturados e purificados usando grânulos de níquel e maltose. O complexo purificado foi carregado em gel SDS-PAGE de 8% e manchado com o azul de Coomassie. (C) purificação de mononucleosome após tratamento com MNase. Cromatina de HEK293T expressando pcDNA. 3 sinalizador-H2A foi extraído e tratado com MNase para gerar e purificar mononucleosomes. Para confirmar a geração de mononucleosome, uma fração da cromatina foi tomada para a extração e a deteção do clorofórmio do fenol a luz UV. O carregamento em gel de agarose a 2% revela um fragmento típico de DNA de base-par 147 indicativo de mononucleosome. (D) foram utilizados mononucleossomas purificados para coloração azul Coomassie. E) ubiquitinação in vitro de nucleossomas. Nucleosomos recombinantes foram incubados a 37 ° c com o dimer de ligase da ubiquitina purificada bacteriana E3, GST-RING1B/BMI1 e E1/E2/ATP/ubiquitina, para os tempos indicados. H2A monoubiquitinação (H2A K119ub) foi analisada por western blotting. (F) ensaio de deubiquitinação de H2A K119ub utilizando o complexo de deubiquitinase BAP1/deubad. Os ensaios in vitro de deubiquitinação foram conduzidos utilizando-se bactérias purificadas his-BAP1/MBP-DEUBAD e os nucleossomas purificados de mamíferos. As reações foram feitas para os tempos indiciados e analisadas por western blotting. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: controles e visão geral do protocolo. (A) BAP1 de mamíferos purificados ou seu mutante morto catalítico (C91S), bem como BAP1 recombinante com bactérias purificadas, foram utilizados para H2A deubiquitinação em nucleossomas. Nucleosomos incubados com tampão isoladamente ou com eluições obtidas da purificação simulada também foram incluídos como controles. (B) BAP1 não deubiquitinar H2A K13/K15 cuja ubiquitinação é mediada por RNF168 ligase E3. HEK293T células foram cotransfectadas com H2A K13R/K15R ou H2A K118R/K119R, juntamente com RNF168 para garantir a ubiquitinação em resíduos K13/K15. Os nucleossomas purificados foram utilizados para a deubiquitinação pelos complexos BAP1. A reação foi interrompida em pontos diferentes do tempo e sujeitada a immunoblotting. (C) purificação de deubad não-ubiquitinated e monoubiquitinated no complexo com BAP1 das pilhas de mamíferos. O complexo purificado foi utilizado para o ensaio de deubiquitinação em nucleossomal H2A K119ub. As reações foram feitas para os pontos de tempo indicados e analisadas por blotting ocidental. (D) BAP1 deubiquitinates H2A K119ub in vivo. HEK293T células foram cotransfectadas com mutantes H2A ou H2A (H2A K118R, K119R, K118R/K119R ou K13R/K15R), juntamente com construções BAP1 e ASXL2. Dois dias após o transfection, as pilhas foram colhidas para immunoblotting usando os anticorpos indicados. (E) representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Existem várias vantagens de estabelecer ensaios de ubiquitinação e deubiquitinação robustos in vitro para proteínas de interesse. Esses ensaios podem ser usados para: (i) estabelecer condições ideais e definir o requisito mínimo para essas reações, (II) determinar as constantes enzimáticas e bioquímicas, (III) definir os papéis de cofatores ou inibidores que podem impactar essas reações, (IV) identificar interfaces de interação, (v) testar o impacto de mutações artificiais ou associadas à doença e (vi) estabelecer condições de ensaio que podem ser utilizadas para desenvolver ensaios de triagem química de alto débito. Aqui, nós exemplificamos estes ensaios descrevendo como nós realizamos o BMI1/RING1B-mediado H2A ubiquitinação e BAP1/asxl-mediado H2A deubiquitination em carcaças o.

A ubiquitinação da histona H2A pode ser recapitulada in vitro usando componentes mínimos, pois a ubiquitinação quase completa de H2A pode ser observada usando o complexo BMI1-RING1B. De notar, esta reação é conduzida em nucleosomos recombinantes. Estes têm a vantagem de estar livre de outras alterações pós-translacionais histonas que ocorrem em células de mamíferos. No entanto, a reação de ubiquitinação também pode ser eficientemente conduzida em nucleossomas nativos. Se a reação de ubiquitinação for fraca, a proporção de enzimas versus substratos pode ser aumentada para observar a ligadura de ubiquitina ideal. Da nota, se as reações do deubiquitination ou os ensaios da interação devem ser conduzidos que seguem o ubiquitinação da carcaça, a seguir o ubiquitinação pode diretamente ser conduzido em carcaças grânulos-encadernadas. A carcaça ubiquitinizadas pode ser recuperada pela tração-para baixo e o sobrenadante que contem os componentes da reação do ubiquitinação pode ser Descartado. No entanto, quando as características enzimáticas devem ser estabelecidas, as enzimas precisam ser eluidas e a estequiometria dos componentes avaliados por cromatografia de exclusão de tamanho.

A reação de deubiquitinação requer menos componentes do que a reação de ubiquitinação. Entretanto, a purificação do DEUBAD sozinho conduz geralmente à precipitação da proteína. Importante, quando o DEUBAD é purified com BAP1, este aumenta extremamente sua solubilidade. De notar, sugerimos a realização de ensaios de deubiquitinação com várias quantidades do substrato e complexo enzimático. A reação de deubiquitinação pode ser inibida por excesso de quantidade de cromatina, o que pode ser explicado provavelmente pelo aumento das concentrações de inibidores associados aos nucleossomas. Observou-se também a deubiquitinação com excesso de BAP1. Assim, vários controles devem ser incluídos, como a incubação de nucleossomas com BAP1 isoladamente (Figura 2a). Também é importante notar que alguns DUBs podem copurificar com cromatina, e mesmo que tratemos cromatina com NEM, DUBs pode ser parcialmente reativado após a adição de TDT, que reduz a cisteína catalítica. Além disso, a metaloproteinase DUBs também pode estar presente, e essas enzimas são insensíveis ao NEM e, portanto, não são inibidos. Portanto, os controles adicionais devem ser incluídos consistindo apenas de nucleossomas sem adição de enzimas e Mutant mutante morto catalítico (Figura 2a). De notar, a especificidade da atividade BAP1 DUB em direção a H2A K119ub está bem documentada e foi validada em nossas condições de ensaio. Purificamos de HEK293T células nucleossomas expressando H2A K118/K119R ou H2A K13/K15R. A expressão de RNF168 leva a uma importante ubiquitinação em K13/K15. BAP1 atividade de DUB só é observada em nucleosalguns contendo H2A K13/K15R correspondendo a H2A K119ub (Figura 2b). Outra consideração é que as modificações pós-translacionais que podem ser críticas para a atividade enzimática provavelmente não estarão presentes em proteínas bacterianas. Assim, reações in vitro utilizando componentes purificados de células de mamíferos também podem ser consideradas35. Por exemplo, a monoubiquitinação de DEUBAD, um processo observado em eukaryotes mais elevados, promove extremamente a atividade do deubiquitinase de BAP135 (Figura 2C). Assim, a purificação de componentes de células de mamíferos também pode ser considerada. Além de reações in vitro, é possível monitorar a atividade de BAP1 DUB diretamente nas células após a transfecção. Por exemplo, transfection de células HEK293T com construção H2A pode dar um sinal claro de H2A K119ub por causa de sua abundância nas células. Nessas condições, a maior parte da ubiquitinação ocorre em resíduos K118/K119, pois a mutação desses sítios para arginina leva à completa ausência de H2A ubiquitinação (Figura 2D). Co-expressando BAP1 e ASXL2 juntamente com H2A permite concluir sobre a atividade BAP1 DUB nas células. No entanto, vários pontos precisam ser considerados como superexpressão pode levar a resultados errôneos. Assim, esses experimentos precisam ser otimizados e bem controlados.

Em síntese, os protocolos aqui descritos, recapitulados na Figura 2e, são simples, não necessitam de uma infra-estrutura especializada ou de uma configuração experimental, podendo ser dimensionados para produzir quantidades substanciais de nucleossomas modificados para múltiplos aplicações a jusante, incluindo ensaios enzimáticos, espectrometria de massas e ensaios de interação proteína-proteína.

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Disclosures

Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a Diana Adjaoud pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado por subvenções do Conselho de pesquisa de ciências naturais e engenharia do Canadá (2015-2020), o genoma Quebec (2016-2019) e o genoma do Canadá (2016-2019) para E.B.A. E.B.A. é um estudioso sênior do Fonds de la recherche du Québec-Santé (FRQ-S). A L. M e a N.S.K. têm uma bolsa de doutoramento da FRQ-S. A H. B teve uma bolsa de doutoramento do Ministério do ensino superior e da investigação científica da Tunísia e da Fundação Cole.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amylose agarose beads New England Biolabs #E8021
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters 10K Sigma-Aldrich #UFC501096
Anti-H2AK119ub (H2Aub) Cell Signaling Technology #8240
Anti-Flag-agarose beads Sigma-Aldrich #A4596
Anti-protease cocktail Sigma-Aldrich #P8340
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL bacteria Agilent technologies #230240
DMEM Wisent #319-005-CL
Empty chromatography column Biorad #731-1550
Flag peptide Sigma-Aldrich #F3290
GSH-agarose beads Sigma-Aldrich #G4510
HEK293T ATCC #CRL-3216
Imidazole Sigma-Aldrich #I5513
Micrococcal nuclease (MNase) Sigma-Aldrich #N3755
Ni-NTA agarose beads ThermoFisher Scientific #88221
N-methylmaleimide (NEM) Bioshop #ETM222
Pore syringe filter 0.45 μm Sarstedt #83.1826
Polyethylenimine (PEI) Polysciences Inc #23966-1
pGEX6p2rbs-GST-RING1B(1-159)-Bmi1(1-109) Addgene #63139
Ub Activating Enzyme (UBE1) Boston Biochem #E-305
UBCH5C (UBE2D3) Boston Biochem #E2-627

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Bioquímica ubiquitinação deubiquitinação E3 ubiquitina ligase PRC1 deubiquitinase PR-DUB cromatina BAP1 ASXL BMI1 RING1B H2A
Ensaios de Ubiquitinação e Deubiquitinação in vitro de histonas Nucleossomal
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