Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Görselleştirme Germinosomes ve Bacillus subtilis sporlar iç zar

Published: April 15, 2019 doi: 10.3791/59388
Automatic Translation
1, 1, *2,3, *4, *1
1Molecular Biology and Microbial Food Safety, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 2Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, 3Confocal.nl BV., 4Dept. of Molecular Biology and Biophysics, UConn Health
* These authors contributed equally

Summary

Germinant reseptör proteinler 'germinosomes' Bacillus subtilis sporlar iç zarda kümesinde. Biz süper çözünürlük mikroskobu ve floresan muhabir proteinleri germinosomes görselleştirmek için bir iletişim kuralı'nı açıklar. İletişim kuralı da tercihen membran boya FM4-64 ile lekeli spor iç zar etki alanları tanımlar.

Abstract

Sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk neden epifluorescence mikroskobu kullanarak onların Mikroskopik analizler zorluklar. Süper çözünürlük üç boyutlu yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (3D-SIM) bu engeli aşmak ve Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar çimlenme sürecinin moleküler ayrıntıları ortaya çıkarmak için umut verici bir araçtır. Burada, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) nasıl kullanılacağını açıklar-Yardımcısı 3D görüntüleme işlemi ve floresan muhabir proteinler B. subtilis sporlar germinosomes, kümelere çimlenme proteinlerin SIM mikroskopi için. B. subtilis spore zarı FM4-64 boyama için (Standart) 3D-SIM görüntüleme yordamı da mevcut. Bu yordamları kullanarak germinosome yerelleştirme için eşsiz çözünürlük elde edilen ve gösteri > uyuyan sporlar elde sporulation tanımlanmış en az BEZLERİ orta sonra B. subtilis KGB80% 80'i-si olmak bir ya da iki GerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde. Parlak foci Ayrıca içinde gözlenen FM4-64 sporlar 3D-SIM görüntüleri iç membran lipid etki alanından farklı akışkanlık olasılığı bulunduğunu düşündüren lekeli edildi. Daha fazla co yerelleştirme değerlendirmek ve böylece en iyi genel Bacillus çimlenme proteinlerin kuruluşun iç spore membran almak için çift muhabir proteinler membran boyalar ve germinosome yordamları etiketleme kullanın çalışmalar vardır mümkün.

Introduction

Sporlar siparişlerin Bacillales ve Clostridiales metabolik olarak uyuyan ve olağanüstü dayanıklı sert dekontaminasyon rejimler, ama onlar çimlenme sürece, zararlı etkileri insanlar1' neden olamaz. İçinde besin germinant tetiklenen çimlenme Bacillus subtilis (B. subtilis) sporlar, inisiyasyon olay germinant reseptörleri (gr) Spor'ın iç zar (IM) yer alan germinant bağlamadır. Daha sonra GRs sinyalleri de IM içinde bulunan SpoVA kanal protein transduce. Bu spor çekirdek pyridine-2,6-Dikarboksilik asit (dipicolinic asit; Satım başlangıcı olur DPA; spore çekirdek kuru wt % 20'si oluşan) SpoVA kanal üzerinden su için. Daha sonra korteks peptidoglikan hidroliz aktivasyonu DPA serbest tetikler ve2,3,4ek su alımını izler. Bu olaylar için mekanik stres yol kat kat, onun sonraki rüptürü, akıbet başlangıcı ve son olarak, bitkisel büyüme. Ancak, çimlenme işleminin tam moleküler ayrıntılarını hala uzakta çözümlenir.

Spor çimlenmesi hakkında önemli bir soru IM çimlenme proteinler ve IM SpoVA kanal proteinler çevreleyen lipidler biyofiziksel özellikleri ile ilgili. Bu büyük ölçüde hareketsiz IM lipid bilayer bazıları kendi eylem spor çekirdek veya bitkisel hücre sitoplazma5,6sarfetmek toksik kimyasal koruyucu dahil olmak üzere birçok küçük moleküller için ana geçirgenliği engeldir. IM5mobil lipidler önemli bir kısmını olsa bir jel durumda IM lipid bilayer olasıdır. Spore's IM de önemli genişleme5için potansiyele sahiptir. Böylece, 1.6-fold IM yüzey alanını artırır çimlenme olmadan ek membran sentezi üzerine ve bu zar'ın karakteristik düşük geçirgenlik ve lipid hareketsizlik5,6kaybı tarafından eşlik ediyor.

Çimlenme proteinler aktivasyonu ve sporlar IM lipidler organizasyonu moleküler ayrıntılarını çalışma için çekici konular olsa da, B. subtilis sporlar küçük boyutu ve çimlenme proteinler, nispeten düşük bolluk bir meydan okuma teşkil Mikroskopik analizler için. Griffiths vd. epifluorescence mikroskop kanıt zorlayıcı, floresan gazetecilere çimlenme proteinler için erimiş kullanarak önerir B. subtilis sporlar üç GR alt birimleri (A, B ve C) GerA, B ve K GRs iskele protein GerD düzenler, bir küme7'. Bu küme çimlenme proteinlerin için 'germinosome' terim icat ve yapıları ~ 300 nm büyük IM protein foci8olarak nitelendirdi. Spor çimlenmesi başlatılması floresan germinosome foci sonuçta değiştirmek içine daha büyük dağıtmak floresan desenleri ile > sporlar bu modeli görüntüleme spore nüfusun % 75 germinated L-Valin8ile 1 h için. Kullanılan yukarıda belirtilen kağıt istatistiksel güç kazanmak ve görüntüleme sırasında gözlenen düşük floresan sinyallerini engeli aşmak için ardışık floresan resimlerin düzinelerce görüntülerden ortalama Not. Bu görselleştirme bakteriyel sporlar bu yapıların klasik mikroskobik araçları ve ben de foci bir tek spor miktarı değerlendirilmesi teknik açıdan ne de ne de onların daha ayrıntılı hücre altı yerelleştirme yapıldı Bu yaklaşım ile mümkün.

Burada, biz, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (detaylı görsel öğeyi almak için SIM) kullanımı ve sporlar B. subtilisyanı sıra kendi IM lipid etki alanları9germinosome(s) miktar göstermek. Protokol için de yönergeler sporulation, slayt hazırlama ve görüntü analizi SIMcheck (v1.0, bir imageJ eklenti) tarafından ImageJ10,11,12yanı sıra içermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. B. subtillis Sporulation (zamanlama: mikroskobik gözlem önce 7 gün)

  1. Gün 1
    1. Bir bakteri kültürü bir Luria-Bertani suyu (LB) agar plaka (%1 tryptone % 0.5 Maya ekstresi, %1 NaCl, %1 agar)13 tarihinde çizgi ve gecede 37 ° C de tek kolonileri elde etmek için kuluçkaya. B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi, gerD-gfp kan) zorlanma ve onun üst arka plan zorlanma B. subtilis PS4150 kullanın (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)7daha önce açıklandığı gibi.
      Not: Sporlar ΔcotEΔgerE arka plan ile kullanımı, germinosome görsel öğeyi spore kat kat7autofluorescence en aza indirmek için esastır.
    2. Tüm medya, tüpler, pipets ve uygun yöntemleri ile kullanılmak üzere diğer kültür malzemeleri sterilize.
  2. 2. gün
    1. Bir koloni 5 mL LB orta de sabah erken aşılamak ve OD600 0,3-0,4 (yaklaşık 7 h) ulaşıncaya kadar kültür sürekli ajitasyon bir vidalı kapak tüp 200 d/d/dak ve 37 ° C altında kuluçkaya.
    2. SÜPÜRGEYİ orta (pH 7.5) 500 mL olun içeren 3 nM (NH4)6Mo7O24·4H2O, 0.4 mikron H3BO3, 30 nM CoCl2·6H2O, 10 nM CuSO4·5H2O, 10 nM ZnSO4·7H2O, 1.32 mM K2HPO4, 0.4 mM MgCl2·6H2O, 0.276 mM K2kadar4, 0.01 mM FeSO4·7H2O, 0.14 mM CaCl2·2H2O, 80 mM MOPS, 4 mM Tricine, 0,1 mM MnCl2·2H2O, 10 mM D-glikoz-monohidrat ve 10 mM NH4Cl.
    3. Vidalı kapak tüpler 10-1- 10-7 seri dilutions 5 ml LB kültürünün BEZLERİ orta hazırlayın ve kültürler gecede 200 d/d/dak ve 37 ° c de sürekli ajitasyon altında kuluçkaya
      Not: Burada hazırlanan seri dilutions ertesi sabah erken üssel faz bir seyreltme elde hedefliyoruz. Bu adımı ve sonraki adım hücrelere BEZLERİ tamponlu büyüme ortamına uyum sağlamak gereklidir.
  3. 3. gün
    1. 0,3-0,4 BEZLERİ dilutions bir OD600 ile birini seçin. Önceden ısıtılmış (37 ° c) BEZLERİ orta 20 mL konik 250 mL şişe içinde kültürünün 0.2 mL aşılamak ve OD600 0,3-0,4 (~ 7 h) ulaşıncaya kadar altında sürekli ajitasyon kuluçkaya.
    2. Adım 1.3.1 den %1 (v/v) öncesi kültür ile SÜPÜRGEYİ tabanlı sporulation orta (250 mL) aşılamak ve sürekli ajitasyon altında bir konik litre şişe içinde 37 ° C'de 3 gün kuluçkaya. FM4-64 PS4150 sporlar boyama için 2 µg/mL FM4-64 sonda ( Tablo malzemelerigörmek) sporulation orta 1 veya 2 h için bitkisel büyüme (genellikle yaklaşık 2) OD600 değeri en yüksek ulaştıktan sonra ekleyin ve kültür için daha sonra ışık5korumak iken sporulate.
  4. 7. gün: sporlar hasat
    1. Faz parlak sporlar faz karanlık hücrelerden ve muhtemelen olgun sporlar ayırt etmek için 100 X büyütme oranında faz kontrast mikroskobu kullanılarak sporulation verim (sporlar vs bitkisel hücreleri) belirlemek. % 90'ı faz parlak spore verim bekleniyor.
    2. Sporlar 4270 x g yuvarlak alt santrifüj tüpleri 4 ° C'de 15 dakika, cips. 2 - 3 kez ile 40 mL steril ultra-saf tip demineralize 1 su spor Pelet ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik santrifüj tüplerde yıkayın. Spin aşağı, her yıkamada 4270 x g 15 dakika (4 ° C).
  5. 7 gün: Spore arıtma
    1. Spore arıtma: spore Pelet % 20 Nonyonik yoğunluk gradient orta 750 µL içinde askıya alma ( malzemelerin tabloyabakın) ve yük % 50 Nonyonik yoğunluk gradient orta sterilize microcentrifuge tüpler 800 µL üzerine. Santrifüj 21,500 x gde 60 dk için. Elde edilen Pelet ücretsiz sporlar içerir. Spore Pelet % 20 Nonyonik yoğunluk gradient orta 200 µL içinde askıya alma ve 1 mL % 50 Nonyonik yoğunluk gradient orta microcentrifuge tüp ve santrifüj 21,500 x gde 15 dakika içinde üzerine yükleyin.
    2. Final spor hazırlık ve depolama yıkama: Pelet elde edilen arıtılmış uyuyan sporlar içerir. Spore Pelet 1,5 mL steril ultra-saf tip 1 ile 2 - 3 kez ( Tablo malzemelerigörmek) su ve spin arasında 9,560 x g 4 ° C'de 15 dakika, aşağı yıkama Son olarak, yaklaşık 30 son OD600 steril ultra-saf Type 1 suda Pelet askıya alma. Aliquots sporlar, 8 hafta14-80 ° C'de muhafaza edilebilir.

2. birleştirilmiş

  1. PS4150 sporlar tedavi (SDS) ile 0.1 M NaCl/0,1 M NaOH/1% Sodyum Lauryl Sülfat / 0,1 M dithiothreitol (DTT) 1 h. için 70 ° C'de yıkama sporlar 10 kat ile sterilize ultra-saf Type 1 su15,16. Böylece, herhangi bir spor'ın dış membran FM4-64 soruşturma adsorbe ve dış katmanlarını kaldırılacak.

3. Coverslip ve slayt hazırlama11 (zamanlama: 1s gözlem önce)

  1. 30 dk içinde hafifçe sallayarak bir su banyosu için 1 M HCl ile önceden temiz yüksek hassasiyetli coverslips ( malzemelerin tabloyabakın). Coverslips iki kez ultra-saf Type 1 suda yıkayın ve %100 (vol/vol) alkol depolayabilirsiniz. Bırak kuru ve onların netlik kullanmadan önce doğrulayın. % 70 cam slaytlar önceden temiz alkol. Bırak kuru ve onların netlik kullanmadan önce doğrulayın.

4. örnekleme floresan mikroküreler veya sporlar Gene çerçevesinde slayt (15dk zamanlama)10

  1. İki % 70 alkol temizlenmiş önceden sıcak ve 70 ° C Isıtma blokta birkaç saniye ( malzemelerin tabloyabakın) kurutulmuş cam slaytlar hava, steril % 2 özel bir cam slayt üzerine 70 ° C'de tutulan 65 μL damla ve diğer cam slayt özel b yaymak için üzerinde yer rasında slaytlar. Özel yama yaklaşık 5 dakika içinde kuruyacak.
  2. Cam slaytlardan birini çıkardıktan sonra 1 x 1 cm bölümüne özel yama kesmek, 0.4 μL örnek (floresan mikroküreler veya ~ 108/mL sporlar) ekleyin ve coverslip yama üzerine yerleştirerek yüksek hassasiyetli coverslip üzerine yama transfer ve kapalı kayar.
  3. Böylece slayt kullanılmak üzere mikroskobu Tamamlanıyor çerçeve, her köşesinde kapanış coverslip üzerine yerleştirilir kurutulmuş slayda bir gen çerçeve (1.5 x 1.6 cm2, 65 µL) düzeltmek.

5. görüntüleme11,17(zamanlama: 1 H)

  1. Sporlar iletim ve floresan görüntülerin yanı sıra kırmızı karışımı yakalamak ve sarı-yeşil karboksilat-modified floresan mikroküreler yapılandırılmış aydınlatma mikroskop üzerinde petrol objektif () x 100 ile donatılmış ( malzemelerin tabloyabakın) Sayısal diyafram 1.49 =), bir CCD kamera ve görüntü analiz yazılımı ( malzemelerin tabloyabakın). Ortam ışığı karışıklık olmadan oda sıcaklığında tüm görüntüler oluşturmak. Her zaman 100 x amaç ve slayt görüntüleme önce % 75 etanol ile temizlemek emin olun.
  2. 100 nm (çapı) floresan mikroküreler üzerinde odaklanmak ve simetrik psf elde edilir, böylece görüntü bulanık en aza indirme kadar 100 x objektif düzeltme halkada ayarlayarak yaymak noktası işlevi (psf) en iyi duruma getirme. Psf impuls cevabı ya da bir nokta kaynak veya point nesnesi bir görüntüleme sisteminin yanıtı var.
  3. Görüş alanı yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküreler ile seçin. Bir ızgara geçerli odak ayarı ile her iki 561 nm ve 488 nm uyarma dalga uzunlukları görüntü analiz yazılımı için rehber olarak.
  4. Sporlar iletim ışık ile odak ve bir iletim ışık her resim için 200 ms pozlama ile 16 × ortalama modunda çekim.
  5. Sporlar 14 bit ve EM kazanç 175, aydınlatma modu "3D-SIM", kamera ayarlarını okuma moduna elektron teksir makinesi (EM) kazanç 10 MHz ile 3D-SIM ham floresan görüntülerini yakalamak. PS4150 sporlar 561 nm lazer ışık % 20 lazer gücü ile FM4-64 soruşturma ve 400 ms bir aydınlatma süresi heyecanlandırmak.
  6. GerKB-mCherry heyecanlandıracak ve GerD-GFP KGB80 içinde sporlar ile sırasıyla, 561 nm lazer % 30 lazer güç ışığı 1 için s ve % 60 488 nm lazer ışık 3 s. Z-yığını ayarlar modu, 0.2 µm alt / adım için üst, 7 adımlar ve germinosome için 20 adımları için güç lazer ve IM analizi, anılan sıraya göre.
    Not: Bu lazer parametreler çubuk grafik penceresi yaklaşık 4000 maksimum parlaklık değeri sağlamak için uygulandı.

6. yeniden FM4-64 PS4150 sporlar lekeli 3D-SIM ham görüntüleri

  1. N-SIM dilim imar PS4150 sporlar ham veri lekeli FM4 64 için gerçekleştirin. N-SIM dilim yeniden yapılandırma penceresini açmak için N-SIM defteri sekmesi sayfa Yeniden dilim için Param butonuna tıklayın.
  2. Yeniden parametreler N-SIM dilim imar penceresinde ayarlayın. Mükemmel yeniden oluşturulan görüntüler elde etmek için öneri N-SIM yönergeleri izleyin ve uygun denetimleri Otomatikolarak, yüksek Aydınlatma modülasyon kontrast (IMC) ayarlamak için N-SIM dilim imar penceresinde tıklatın Çözünürlük gürültü bastırma (HRNS) 1.00 ve Odak görüntü bastırma (OFBS) dışarı için başlangıç noktaları olarak 0,05.
  3. Görüntüyü yeniden oluşturmak için N-SIM dilim imar penceresinde Dilimi yeniden düğmesini tıklatın. Fast Fourier dönüşüm (FFT) görüntüler ve yeniden yapılanma12' den sonra görüntülemek imar skor tarafından yeniden oluşturulan görüntülerin kalitesini değerlendirmek.
  4. 0,10 itibaren HRNS ayarlamak 5,00 ve OFBS 0,01 iyi parametre ayarları elde edilen kadar tıklayarak N-SIM dilim imar penceresinde uygun kontrollerin 0,50.
  5. N-SIM dilim Reconstuction değişen parametreleri geçerli pencereye Uygula düğmesini tıklatın. Pencereyi kapatmak için Kapat düğmesini tıklatın.
  6. Bir FM4-lekeli PS4150 sporlar raw görüntü etkin ve N-SIM Pad sekme sayfasında Yeniden dilim düğmesini tıklatın Dilim yenidenyürütmek için 64 olun. Yeniden oluşturulan resmi kaydedin.

7. görüntü analizi

  1. KGB80 germinosome pseudo-Widefield görüntüleri dönüştürmek
    1. 3D-SIM KGB80 ham görüntülerini bir sol tıklama ile SIMcheck yardımcı programı Ham veri SI Pseudo-Widefield12ImageJ eklenti etkinleştirerek Pseudo-Widefield görüntülere dönüştürmek. Pseudo-Widefield ham SIM veri görüntülerden ortalamasını alır ve toplanır, karşılaştırma için görüntüyü geleneksel widefield aydınlatma12' ye eşdeğer. ImageJ için https://imagej.net/Welcome bakın. Rastgele ~ 25 sporlar floresan Pseudo-Widefield görüntüleri daha sonra germinosome analiz için her ters iletim görüntü seçin.
    2. Toplamda yaklaşık 350 (Bu örnekte, 346) KGB80 sporlar içinde iki slayt bakıldığında 14 alanları seçin. Seçili KGB80 sporlar GerD-GFP ve GerKB-mCherry floresan foci sayılar bağımsız olarak iki araştırmacılar tarafından dikkate. Araştırmacı geri 3D-SIM pişmemiş imge ne zaman sporlar ayrı floresan germinosome foci varlığı şüphe içinde anlamlara gelebilir.
    3. Her GerD-GFP ve GerKB-mCherry odak en büyük şiddetlerde ve her KGB80 spore's 3D imge ImageJ ile entegre şiddetini değerlendirmek.
  2. Pseudo-Widefield KGB80 germinosome görüntülerini analiz
    1. 7 yığınları ortalama entegre yoğunluk değerini KGB80 spor tümleşik sinyal şiddeti kullanın. Arka plan yoğunluklarda aynı ayarları kullanarak arka plan zorlanma PS4150 Imaging tarafından belirler. Arka plandan açıkça ayırt olduklarında floresan noktalar tek tek KGB80 sporlar germinosome foci görür.
    2. Yazılım kökenli 9.0 kararlılıkla önemi için tek yönlü ANOVA testleri uygulanır. P değerleri dikkate alınarak < 0,05 istatistiksel olarak önemli. Spearman'ın sıralama korelasyon katsayısı18 GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci numarası korelasyon ve tümleşik sinyal şiddeti ölçümleri değerlendirmek için kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Geçerli protokol bakteriyel sporlar için bir SIM mikroskop düşsel yordam sunar. Sporulation ve slayt hazırlama işlemleri görüntüleme önce şekil 1 ' de gösterildiği gibi yapılmıştır. Daha sonra görüntüleme ve analiz prosedürleri uygulanmış olan her ikisi için dim (floresan protein çimlenme protein etiketli) ve parlak (lipofilik sonda IM lekeli) Spor örnekleri aşağıdaki metinde görüldüğü gibi.

B. subtilis sporlar germinosomes lokalizasyonu

Mide ve GerKB düzeylerini rapor edilir olmak ~ 3500 ve ~ 700 molekül başına spore, anılan sıraya göre bir zengin sporulation orta19' hazırlanan sporlar gelen özler Western blot analizlerini dayalı. KGB80 zorlanma mide-gfp ve gerKB-mCherry genlerinde onların yerli promotor denetiminde olan. SIM imar algoritması tarafından böyle loş raw SIM resimleri birleştirmeye zor bu yüzden göreceli düşük bereket füzyon proteinlerin görüntüleme sırasında düşük floresan sinyal için yol açtı. Ancak, ham SIM görüntüleri Pseudo-Widefield görüntülere SIMcheck (ImageJ eklenti) tarafından dönüştürüldü, ancak SIM mikroskop hala germinosome resim alma için uygulandı. Ayrıca, yedi yığın 3D görüntüleme bu IM odak daha iyi bir görünümünü almak için uygulanmıştır. Şekil 2sol panelinde gösterildiği gibi mide-GFP iki resimde farklı yığınlarda ortaya çıktı. , Toplamda üç GerD-GFP foci beyaz ok compositive sütunun Z3 yığın halinde gösterilir. Şekil 2 sağ paneli tek bir GerD-GSYİH odak noktası ile bir spor içinde spor olarak kompozit sütunun Z4 yığın beyaz ok kanıtladığı gösterir. Toplamda, yaklaşık % 40 ve % 50'sini sporlar iki veya bir GerD-GFP ve GerKB-mCherry küme, sırasıyla vardı (Tablo 1). Muayene 346 sporlar arasında iki 4 GerD-GFP foci, ve bir spor bile 5 GerD-GFP foci vardı. Fark, bizim elimizde, GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci aynı spor sayısı her zaman aynı18değildi. SIM mikroskop faz kontrast seçeneği olduğu gibi iletim ışık mikroskobu spore yerelleştirme için kullanılan. Böylece, sporlar daha parlak bir hale tarafından çevrili bir kara ve yoğun çekirdeği ile görünür.

KGB80 sporlar entegre floresan yoğunluğu ImageJ tarafından ölçüldü. Sporlar, 0, 4 veya 5 foci vardı onların düşük frekans nedeniyle istatistiksel analiz içine dahil değildir. GerD-GFP ve GerKB-mCherry entegre yoğunluklarda arasında yüksek pozitif bir korelasyon olduğu (Spearman sıralama korelasyon katsayısı 0.73 =). GerD-GFP iskele protein entegre yoğunluğunu farklı popülasyonlar arasında (şekil 3 c) farklı iken, GerKB-mCherry entegre yoğunluğunu farklı popülasyonlar (şekil 3D) aynı hakkında oldu. GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci maksimum Floresans yoğunluğunu azaltmak, spore birden çok resimde (şekil 3A, B) varken eğiliminde. Maksimum floresan germinosome foci kabul tüm parlak noktalar en fazla otomatik Floresans PS4150 sporlar (sporlar arka plan zorlanma KGB80; in daha yüksek Şekil 3A B).

İç zar organizasyonu

Giriş bölümünde de belirtildiği gibi germinosome proteinler spore's IM içinde yer alır. Ancak, bazı bilgiler bu büyük ölçüde hareketsiz membran biyofiziksel özellikleri hakkında bilinir. Im'ın yerel kuruluşun gibi daha fazla ayrıntı keşfetmek IM proteinler, belirli GRs ve kanal proteinler organizasyonu kavrayışı geliştirmek. B. subtilis sporlar birden fazla Eşmerkezli katman oluşan bir yapıya sahip ve bir lipofilik sonda bunlar kolayca spore çekirdeği çevreleyen IM leke için birden çok katman geçirilemez. Bu tür sondalar geçirilmesi büyük olasılıkla protein açısından zengin kat kat ve belki de dış membran20,21engel oluyor. Bu sorunu çözmek için lipofilik membran boya FM4-64 sporulation sırasında PS4150 kültür eklendi. Böylece, PS4150 bitkisel hücre zarı FM4-64 tarafından lekeli ve böylece bu kültür asimetrik sporulation hücre bölünmesi ve sonraki forespore engulfment elde edilen forespores membranlar de5lekeli. Sonuç olarak, olgun spore's membranlar görüntülenmeyecektir. Bir önceki çalışma en değilse tüm FM4-64 olduğunu içinde temizlenmiş sporlar5' ım belirtti. Bir kuluçka ve spor arıtma tedavilerinin yaklaşık 2 hafta döneminde uygulanan çamaşır yordamlar herhangi bir FM4 64 dış membran, ikinci etkili decoating tedavi kaldırılmakta ve kapsamlı adımlar yıkama kaldırmak 5. ancak, decoating yordam hiçbir FM4 64 IM--dan kaldırır, ne de germinosome foci5,6üzerinde herhangi bir etkisi yoktur. Ne bize heyecanlı daha parlak FM4-64 noktalar germinosome foci için benzer her iki sağlam (4A şekiliçindeB) ortaya çıktı ve PS4150 sporlar sporlar (şekil 4 c, D) decoated olduğunu. Bu parlak FM4-64 noktalar IM germinosome proteinlerin Kümelemede söz konusu.

Figure 1
Şekil 1: sporulation ve slayt hazırlama bakış. Görüntüleme önce ilk adımları gösteren bir özeti. Ayrıntılı bilgi iletişim kuralında verilir. (A) tanımlanmış en az BEZLERİ sporulation yordamda şematik orta. B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) veya KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi gerD-gfp kan) koloni 5 mL LB zengin Orta kültürlü ve 5 mL ve SÜPÜRGEYİ 20 mL adapte Orta sırayla ve sonunda 250 mL BEZLERİ orta sporulated. Bir erken üssel faz kültür (OD600, 0,3-0,4) bütün ara kültürlerde kullanılır. FM4-64 (2 µg/mL) 1 veya 2 s tepe OD600 değeri ulaştıktan sonra boyama spor membran PS4150 sporulation orta eklendi. PASPAS sporulation kültür gelen sporlar hasat ve sporlar yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından arındırıcı (B) yöntemi. (C) % 1'özel defterinde bir gen çerçeve odasında sporlar sabitleme prosedürü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Temsilcisi Pseudo-Widefield (PWF) 3D görüntüleri, GerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde iki KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi gerD-gfp kan) atıl sporlar 3D-SIM pişmemiş imge içinde çift kanallı uyarma (561nm, % 30 lazer güç, alındı 1 s ve 488nm, %60 lazer gücü, 3 s) üst 7 adımları yukarıdan aşağıya doğru Z-yığınları kullanarak. Daha sonra ham SIM görüntüleri Pseudo-Widefield 3D görüntülere ImageJ plugin SIMcheck tarafından dönüştürüldü. Soldan sağ, 3 boyutlu görüntüleri (Z2-Z5) GerD-GFP (yeşil), GerKB-mCherry (kırmızı) ve iki KGB80 sporlar (ı ve II) karşılık gelen bileşik görüntüler panelinde gösterilir. İki sporlar (ı ve II) iletim (Trans) ışık görüntülerini karanlık yoğun görüntüleri daha parlak bir hale tarafından çevrili olarak görünür sporlar konumunu belirtti. Ölçek çubuğu = 1 µm ve tüm panelleri aynı büyütme oranında vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi gerD-gfp kan) atıl sporlar içinde GerD-GFP maksimum floresan yoğunluğu ve PS4150 sporlar rasgele birimlerindeki maksimum auto-floresan yoğunluğu. Tüm sporlar tarafından aydınlatılmış iletişim kuralı ayarları belirtti. Paneller(a)ve (BGerD-GFP ve GerKB-mCherry resimde en fazla floresan yoğunluğu sırasıyla, KGB80 uyuyan sporlar de olduğu gibi her iki durumda da üst PS4150 sporlar maksimum auto-floresan yoğunluğu gösterir). Paneller (C) ve (DGerD-GFP foci entegre floresan yoğunluğu ve GerKB-mCherry resimde entegre floresan yoğunluğu sırasıyla, B. subtilis KGB80 uyuyan sporlar gösterir). Tek yönlü ANOVA testleri maksimum odak noktası yoğunluğu ve entegre spore Floresans yoğunluklarda yazılım kökenli 9.0 ile farklılıklar belirlenmesi önemi için kullandığımız P değerleri dikkate alınarak < 0,05 olarak önemli. Sporlar 4 veya 5 foci ile analiz onların düşük bereket nedeniyle bırakıldı. Verileri çentikli öğretici olarak boxplots temsil edilir. Onların genişliği ile orantılı interquartile aralığı (IQR) gözlenen ortalama değerler etrafında parsellerde çentikler vardır. Gösterilen bıyık en fazla 1.5 IQR temsil eder. Yıldız medyan değerleri önemli bir fark gösterir. GerD-GFP ve GerKB-mCherry entegre Floresans yoğunluklarda sahip güçlü bir pozitif korelasyon (Spearman korelasyon katsayısı 0.73 =)18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Temsilcisi Pseudo-Widefield (PWF) görüntüleri (A ve C) ve yeniden oluşturulan SIM görüntüleri (B ve D) FM4 64 lekeli B. subtilis PS4150 IM (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet) sporlar. FM-464 sporulation sırasında sporlar dahil oldu. 3D-SIM ham görüntüleri olduğu gibi sporlar (A ve B) ve decoated sporlar (C ve D) bir kanal uyarma (561 nm lazer, % 20 lazer gücü, 400 ms) alınmıştır 25 adım tepeden tırnağa Z-yığın kullanarak. Daha sonra ham SIM veri düşsel bilgisayar yazılımı mikroskop tarafından yeniden ( Tablo malzemelerigörmek) 3D-SIM görüntüler, içine veya SIMcheck (ImageJ eklenti) tarafından PWF dönüştürülmüştür. Mavi okları FM4-64 foci panelinde IM içinde B ve Düzerine gelin. Ölçek çubuğu = 1 mikron ve tüm panelleri aynı büyütme oranında vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Zorlanma Sayılan sporlar Resimde Foci başına spor (%)
0 1 2 3 4 5
KGB80 346 GerD-GFP 2 46 40 11 1 0
GerKB-mCherry 2 53 40 5 0 0

Tablo 1: KGB80 sporlar foci varlığı. Spore kadar çift B. subtilis KGB80 etiketli bir nüfus başına germinosome foci sayı (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry kedi gerD-gfp kan) atıl sporlar. Sporlar Floresans sayılır germinosome foci zaman bir odak en fazla yoğunluk PS4150 en fazla yoğunluğu olan otomatik floresan yoğunluğu yüksek (PS832 ΔgerE::spc ΔcotE::tet) Uyuyan sporlar KGB80 sporlar aynı aydınlatma ayarları tarafından heyecanlı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sunulan Protokolü FM4- B. subtilis sporlar lekeli sporulation, slayt hazırlama ve işlemleri görüntüleme içeren 64 çözümlenmesi için bir standart 3D-SIM yordam içerir. Ayrıca, değiştirilmiş SIMcheck (ImageJ) protokolünü açıklar-işlem için SIM mikroskobu ile floresan gazetecilere etiketli B. subtilis spor germinosomes, Imaging 3D destekli. İkinci yordamı bu loş altyapı geliştirilmiş kontrast ile gözlemlemek için bize izin. İki görüntüleme yordam kaplin tarafından böylece çimlenme işleminin mekanik bir anlayış için bizim temel artırmak aynı SIM mikroskop ile aynı spor ayrı alt yapıları görselleştirmek mümkündür. Yordamı ~ 100 yanal çözünürlükte çalışır not nm ve Aksiyel bir çözünürlük ~ 200-250 nm. Griffith7tarafından kullanılan fark girişim kontrast (DIC) geniş alanlı mikroskobu yaklaşım daha iyi bu. Zaman analiz inisiyasyon çimlenmesi üzerine germinosome görünümünü istediğiniz bir sonraki adım olacaktır çözüldü. Ne yazık ki, SIM mikroskobu ilke ile uyumlu olsa da canlı görüntüleme, germinosome loş doğası gereği böyle zaman çözüldü SIM sinyalleri, analizleri hızlı örnekleri resim alma sırasında ağartma nedeniyle mümkün değildir. Analiz için yeterli sporlar elde etmek için bu sporulation etkin bir şekilde yer alıyor emin olmak önemlidir. Araştırmacılar bu nedenle hedef olarak % 90 verim verimlilikle titizlikle sporulation iade etmeniz gerekir. Temsilcisi sonuçlarında uyuyan sporlar içinde sırasıyla ~ %50 ve tüm sporlar % 40'ını bir ya da iki GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci (Tablo 1) var. Sporlar ile iki foci yüzdesi çok Griffiths tarafından bildirilen daha yüksek daha önce7. Geçerli çalışmalarında farklı sonuç açıklayabilir çeşitli nedenleri vardır. İlk olarak, işlem Imaging 3D daha fazla foci tespiti kolaylaştırabilir. Aynı spor farklı foci farklı yerlerde dikey yönde şekil 1' de gösterildiği gibi yer alır. İkinci olarak, CCD kamera (Malzemeler tablo) ve SIM mikroskop donatılmış lazer birlik önemli ölçüde görüntüleme sonuçlarına katkıda. Üçüncüsü, benzer Griffiths'ın yaklaşımı7 ortalama daha iyi görüntü analizi için ardışık görüntüler düzinelerce için germinosome Pseudo-Widefield görüntü Ayrıca ham SIM görüntüleri (5 aşamaları ve 3 yönelimleri resim) ortalama bir görüntü oldu. Son olarak, sporulation orta ve sporulation koşulları, spore özellikleri, belirlemede önemli bir değişken daha önce kullanılan çalışmalarda farklı. Griffiths vd.7 kullanılan zengin 2 x Schaeffer'ın-glikoz (2 x SG) için tanımlanmış en az BEZLERİ ise sporulation orta tampon orta burada istihdam edildi. Birkaç sporulation orta ve koşullar protein kompozisyon, direnç, üzerinde önemli etkileri vardır ve çimlenme B. subtilis ,22,23,24 sporlar göstermiştir , 25. GR alt birimleri düzeyleri daha düşük olanlar zengin-ortamda elde karşı zavallı bir ortamda elde edilen sporlar 3 - için 8 - kat olduğunu gösterilmiştir gerçekten de. GerD düzeyleri de zavallı orta sporlar yaklaşık 3.5-fold düşük bulunmuştur ve bu sporlar spor çimlenmesi26başlatmak için uzun sürdü. Ancak, öyle olup olmadığını sporulation koşulları da gözlenen germinosome foci sayısını etkiler açık değildir.

Ramirez-Peralta ark.' s sonuçları26 sporlar, nüfus düzeyde besin çimlenme oranlarının düzeyini çimlenme proteinler ve GerD tarafından önemli ölçüde etkilenmiştir belirtti. Eğer üzerinden tümleşik floresan yoğunluklarda başına spore floresan gazetecilere mide ve GerKB füzyon protein düzeyleri için doğru orantılı, her iki füzyon protein düzeyleri yaygın olarak farklılık KGB80 sporlar, önceki çalışma ile anlaşma olduğu 7. bu protein düzeyi heterojenite spor çimlenmesi heterojenite tek spor düzeyinde gözlenen ilgili olabilir ve germinosome foci numarası spor çimlenmesi heterojenite için katkıda bulunan bir başka faktör olabilir. Daha fazla deney germinosome foci numarayı olası etki analizi üzerinde durulacak ve çimlenme heterojenite foci çimlenme protein kompozisyon (tüm germinosomes çimlenme protein bileşiminde eşit olabilir) olabilir. Verileri de dahil olmak üzere geçerli araştırma soruları bir sayıya doğuran: Ben) GRs Im; kümeleme GerD rolü nedir ve II) nasıl are belgili tanımlık iki diğer GRs, GerA ve GERB'in, düzenlenen spor IM?

Loş ve parlak spore örnekleri için sunulan protokolü aynı spor ayrı alt yapıları tarafından SIM mikroskobu görselleştirmek sağlar. Sporlar içinde gözlendi parlak FM4-64 noktalar geniş IM27katlama nedeniyle olabilir. Alternatif olarak, bu bölgeler nerede boya daha kolay erişim nedeniyle artan yerel IM akışkanlık elde edebilir im alanlardır öngörmekteyiz. Bu bölgeler, artan akışkanlık (RIFs) hücre iskeleti aktin homologue MreB, iyi bilinen sıvı kısa asil zinciri lipidler28,29, konsantrasyon için tarafından düzenlenmiş olabilir. Fark, vahşi tipi B. subtilis için aynı yordamı uygulayarak sporlar da açar parlak FM4-64 noktalar (bizim yayınlanmamış gözlemler) benzer bir yol. B. subtilis bitkisel hücrelerde, , MreB ve RIFs29Kümelemede daraltılmış membran potansiyeli sonuçlanır. Uyuyan sporlar büyük olasılıkla iç membran bir göreceli düşük membran potansiyeli20,21 vardır ve MreB30 RIFs yüksek akışkanlık29 daha büyük etki alanlarına kümeleme için yol açabilecek tespit düzeyleri içerir . Böyle etki alanlarının germinosomes varlığı ile aynı tarihte olup olmadığını şu anda araştırılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbir çıkar çatışmaları ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar Christiaan Zeelenberg SIM görüntüleme sırasında yaptığı yardım için teşekkür ederiz. JW Çin burs Konseyi için bir Doktora Bursu kabul eder ve Irene Stellingwerf görüntüleme birincil aşaması sırasında ona yardım için teşekkürler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air dried glass slides Menzel Gläser 630-2870
APO TIRF N20R8 100× oil objective (NA=1.49)
B. subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
B. subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
Erlenmeyer flasks 1 L Sigma-Aldrich Z567868
Erlenmeyer flasks 250 mL Sigma-Aldrich Z723088
FluoSpheres carboxylate-modified microspheres Invitrogen, 0.1 μm F8803
FM4-64 Thermo Fisher Scientific F34653
Histodenz nonionic density gradient medium Sigma-Aldrich D2158
ImageJ
iXON3 DU-897 X-6515 CCD camera Andor Technology https://imagej.net/Welcome
LB Agar Sigma-Aldrich L2897
Microfuge tubes 1.5 mL Thermo Fisher Scientific 3451PK
Microscope imaging software Nikon, Japan NIS-Element AR 4.51.01
MilliQ Ultrapure Deminerilzed Water Millipore Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti microscope
Polypropylene Screw Cap Bottle 180 mL Thermo Fisher Scientific 75003800
Precision Coverslips Paul Marienfeld 117650
Round Bottom tubes 15 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM
Screw cap tubes 50 mL Thermo Fisher Scientific Nunc TM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Setlow, P. Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. Journal of Bacteriology. 196 (7), 1297-1305 (2014).
  2. Setlow, P., Wang, S., Li, Y. -Q. Germination of spores of the orders Bacillales and Clostridiales. Annual Review of Microbiology. 71 (1), (2017).
  3. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Analysis of interactions between nutrient germinant receptors and SpoVA proteins of Bacillus subtilis spores. FEMS Microbiology Letters. 274 (1), 42-47 (2007).
  4. Setlow, P. Summer meeting 2013–when the sleepers wake: the germination of spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 115 (6), 1251-1268 (2013).
  5. Cowan, A. E., et al. Lipids in the inner membrane of dormant spores of Bacillus species are largely immobile. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (20), 7733-7738 (2004).
  6. Loison, P., et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1828 (11), 2436-2443 (2013).
  7. Griffiths, K. K., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Germination proteins in the inner membrane of dormant Bacillus subtilis spores colocalize in a discrete cluster. Molecular Microbiology. 81 (4), 1061-1077 (2011).
  8. Troiano, A. J., Zhang, J., Cowan, A. E., Yu, J., Setlow, P. Analysis of the dynamics of a Bacillus subtilis spore germination protein complex during spore germination and outgrowth. Journal of Bacteriology. 197 (2), 252-261 (2015).
  9. Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Scientific Reports. 6, 27290 (2016).
  10. Pandey, R., et al. Live cell imaging of germination and outgrowth of individual Bacillus subtilis spores; the effect of heat stress quantitatively analyzed with SporeTracker. PloS One. 8 (3), e58972 (2013).
  11. Demmerle, J., et al. Strategic and practical guidelines for successful structured illumination microscopy. Nature Protocols. 12 (5), 988-1010 (2017).
  12. Ball, G., et al. SIMcheck: a toolbox for successful super-resolution structured illumination microscopy. Scientific Reports. 5, 15915 (2015).
  13. Bertani, G. STUDIES ON LYSOGENESIS I.: The Mode of Phage Liberation by Lysogenic Escherichia coli1. Journal of Bacteriology. 62 (3), 293 (1951).
  14. Pandey, R., et al. Quantitative analysis of the effect of specific tea compounds on germination and outgrowth of Bacillus subtilis spores at single cell resolution. Food Microbiology. 45, 63-70 (2015).
  15. Zheng, L., et al. Bacillus subtilis spore inner membrane proteome. Journal of Proteome Research. 15 (2), 585-594 (2016).
  16. Vepachedu, V. R., Setlow, P. Localization of SpoVAD to the inner membrane of spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 187 (16), 5677-5682 (2005).
  17. Schouten, M., et al. Imaging dendritic spines of rat primary hippocampal neurons using structured illumination microscopy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  18. Mukaka, M. M. A guide to appropriate use of correlation coefficient in medical research. Malawi Medical Journal. 24 (3), 69-71 (2012).
  19. Stewart, K. A., Setlow, P. Numbers of individual nutrient germinant receptors and other germination proteins in spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 195 (16), 3575-3582 (2013).
  20. Laflamme, C., et al. Flow cytometry analysis of germinating Bacillus spores, using membrane potential dye. Archives of Microbiology. 183 (2), 107-112 (2005).
  21. Magge, A., Setlow, B., Cowan, A. E., Setlow, P. Analysis of dye binding by and membrane potential in spores of Bacillus species. Journal of Applied Microbiology. 106 (3), 814-824 (2009).
  22. Ghosh, S., Scotland, M., Setlow, P. Levels of germination proteins in dormant and superdormant spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 194 (9), 2221-2227 (2012).
  23. Abhyankar, W. R., et al. The influence of sporulation conditions on the spore coat protein composition of Bacillus subtilis Spores. Frontiers in microbiology. 7, 1636 (2016).
  24. Rose, R., et al. Comparison of the properties of Bacillus subtilis spores made in liquid or on agar plates. Journal of Applied Microbiology. 103 (3), 691-699 (2007).
  25. Stewart, K. A., Yi, X., Ghosh, S., Setlow, P. Germination protein levels and rates of germination of spores of Bacillus subtilis with overexpressed or deleted genes encoding germination proteins. J Bacteriol. 194 (12), 3156-3164 (2012).
  26. Ramirez-Peralta, A., Zhang, P., Li, Y. -q, Setlow, P. Effects of sporulation conditions on the germination and germination protein levels of Bacillus subtilis spores. Applied and Environmental Microbiology. 78 (8), 2689-2697 (2012).
  27. Laue, M., Han, H. -M., Dittmann, C., Setlow, P. Intracellular membranes of bacterial endospores are reservoirs for spore core membrane expansion during spore germination. Scientific Reports. 8, 11388 (2018).
  28. Strahl, H., Bürmann, F., Hamoen, L. W. The actin homologue MreB organizes the bacterial cell membrane. Nature Communications. 5, (2014).
  29. Strahl, H., Hamoen, L. W. Membrane potential is important for bacterial cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12281-12286 (2010).
  30. Swarge, B. N., et al. "One-Pot" sample processing methodfor proteome-wide analysis of microbial cells and spores. Proteomics Clinical Applications. (5), 1700169 (2018).

Tags

Biyomühendislik sayı: 146 gram-pozitif bakteriler Bacillales mikroskopi mikrobiyoloji organizmalar bakteri analitik tanı ve tedavi teknikleri ve donanımları soruşturma teknikleri yaşam bilimleri Yaşam Bilimleri (genel) Bacillus Sporlar çimlenme proteinler Germinosomes Spore iç zar süper çözünürlük mikroskobu Floresans mikroskobu
Görselleştirme Germinosomes ve <em>Bacillus subtilis</em> sporlar iç zar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M.… More

Wen, J., Pasman, R., Manders, E. M. M., Setlow, P., Brul, S. Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores. J. Vis. Exp. (146), e59388, doi:10.3791/59388 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter