Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione
Summary
Qui, descriviamo la generazione e applicazione di un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana linee espressione inducibile, tessuto-specifica abilitazione in tre meristemi principali, il meristema apicale di sparare, radice meristema apicale e il cambio.
Abstract
Espressione inducibile, tessuto-specifici è un importante e potente strumento per studiare la dinamica spazio-temporale di perturbazione genetica. Combinando la GreenGate flessibile ed efficiente con il collaudato e analizzato LhGR sistema (qui chiamato GR-LhG4) per l’espressione inducibile di clonazione, abbiamo generato un insieme di linee transgeniche di Arabidopsis che può guidare l’espressione di un effettore Cassetta in una gamma di tipi cellulari specifici nei tre meristemi stabilimento principale. A tal fine, abbiamo scelto il sistema GR-LhG4 precedentemente sviluppato basato su un fattore di trascrizione chimerica e un promotore di cognate pOp-tipo garantendo il controllo stretto sopra una vasta gamma di livelli di espressione. Inoltre, per visualizzare il dominio di espressione dove il fattore di trascrizione sintetica è attivo, un reporter fluorescente mTurquoise2 ER-localizzata sotto il controllo del promotore pOp4 o pOp6 è codificato in linee di driver. Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare una linea driver o effettore e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Utilizzando linee di alcuni o tutti i driver, l’effetto specifico contesto di esprimere uno o molteplici fattori (effettori) sotto il controllo del promotore sintetico pOp può essere valutati rapidamente, ad esempio in piante F1 di un incrocio tra un effettore e multiplo linee di driver. Questo approccio è esemplificato dall’espressione ectopica di VND7, un fattore di trascrizione NAC in grado di indurre la deposizione di parete cella secondaria ectopica in maniera autonoma delle cellule.
Introduction
Una limitazione importante nella biologia, nell’era della postegnomica è quello di decifrare il ruolo specifico del contesto di un determinato fattore o perturbazione genetica. Genetici costitutivi perturbazioni come approcci di funzione di perdita e guadagno di funzione permettono spesso solo endpoint analisi di processi di adattamento permanente, offuscando la distinzione tra effetti primari e secondari. Inoltre, funzioni specifiche di contesto possono essere mascherate o diluite dagli effetti su larga scala nei tessuti distanti o durante altre fasi di sviluppo. Inoltre, in casi estremi, letalità può precludere qualsiasi visione meccanicistica. Idealmente, per ovviare a questi problemi, si potrebbe analizzare l’effetto di perturbazione acuta genetica all’interno di un contesto specifico come uno specifico tipo cellulare in un modo risolta nel tempo. Per raggiungere questo obiettivo, strumenti genetici per inducibile, espressione di tipo specifico delle cellule sono necessarie1. Per fornire una risorsa per la rapida valutazione spazio-temporale della dinamica di una risposta a un determinato effettore, abbiamo combinato la facilità della clonazione fornito da GreenGate system2 con la provata efficacia del GR-LhG4 system3, 4,5,6. Abbiamo generato una serie di linee che esprimono il fattore di trascrizione chimerica che lhg4 fusa per il dominio di legame del ligando del ratto del corticoide del ricevitore (GR)7 sotto il controllo di ben caratterizzati cella tipo promotori specifici8. In condizioni di riposo, il fattore di trascrizione rimane di fuori del nucleo, come il dominio GR è vincolato il HSP90 citosolico. Con l’aggiunta di ligando sintetico desametasone (Dex), traslocazione nucleare è indotta e LhG4 medierà trascrizione delle cassette di espressione sotto il controllo di un promotore sintetico cognate pOp-tipo , come un reporter di mTurquoise2 tra le linee di driver per visualizzare il dominio di espressione dopo induzione. Così, le linee di driver tecnicamente inoltre contengono una cassetta dell’effettore. L’attraversamento di un insieme di driver linee con una linea che trasportano una cassetta effettrici con, ad esempio, un gene di interesse sotto il controllo dello stesso tipo di pOp promotore così permette la rapida valutazione delle conseguenze acute o a lungo termine dell’espressione dell’effettore in una vasta gamma di tipi di cellule.
Qui, forniamo un protocollo che descrive le procedure necessarie per generare le linee pilota ed effettrici e dimostrare come espressione specifica del tipo di cella può essere indotta e seguita nel meristema apicale sparare, radice meristema apicale e il cambio di Arabidopsis. Per illustrare la bravura e la specificità di questo approccio, utilizziamo il fattore di trascrizione ben noto VND7 che è in grado di pilotare ectopically cella secondaria xilema-come agenti d’ispessimento parete9. Trattamento di F1 da un incrocio tra la riga di driver pSCR11 10,e la linea di effettori pOp6:VND7 conduce alla formazione ectopica xilema-come delle cellule nel fodero dell’amido staminali cellule di Arabidopsis .
Per facilitare la generazione di grandi assiemi di DNA richiesto per la costruzione di driver ed effettrici plasmidi di espressione, abbiamo usato il veloce ed efficiente GreenGate clonazione metodo2. Clonazione di GreenGate è basato sugli enzimi di limitazione di tipo II S come Eco31I o sua isoschizomer Bsami2. Questi enzimi tagliato a valle dei rispettivi siti di riconoscimento asimmetrica producendo strapiombi con varia composizione base. Incorporando Eco31I /Bsaho siti di restrizione nell’oligonucleotidi e allocare sbalzo specifiche sequenze di elementi del DNA, clonazione modulare è raggiunto, facilitare la generazione di grandi assiemi. Nel quadro GreenGate, moduli di DNA si dividono in categorie A-F basato sulla sequenza di sporgenza che fungono da adattatori e vengono assemblate in quell’ordine. Pertanto, il primer disegnati per amplificare il vostro prodotto desiderato dovrebbe essere secondo il modulo selezionato2 (Figura 1A). Se c’è un interno Eco31I /BsaI sito e la sequenza non è compatibile con i moduli di ingresso e destinazione di GreenGate, si può procedere senza mutagenizing, ma con minore efficienza. In alternativa, utilizzare mutagenesi sito-diretta per rimuovere Eco31I /Bsaho siti di restrizione facendo attenzione a non per cambiare gli amminoacidi in prodotti del gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo i passaggi necessari per generare e applicare un toolkit completo e versatile per inducibile, cella tipo specifico trans-attivazione. Linee trasporto cassette effettrici sotto il controllo del promotore pOp con driver linee incrociate permette di studiare gli effetti di mis-espressione nella generazione F1, consentendo la rapida valutazione genetica perturbazione in una vasta gamma di tipi di cellule. In alternativa, effettore costrutti possono essere utilizzate per trasformare driver l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lavoro nei nostri laboratori è sostenuto dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) sovvenzioni WO 1660/6-1 (a S.W.) e GR 2104/4-1 (a T.G.) e SFB1101 (da T.G. e J.U.L) e da un Consiglio europeo della ricerca consolidator concedere (PLANTSTEMS 647148) a T.G. S.W. è supportato attraverso il Emmy Noether Fellowship del DFG attraverso Grant WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
Riferimenti
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