유도할 수 있는, 애기 thaliana 통해 LhGR 중재 트랜스에 셀 형식 관련 식-활성화
Summary
여기, 우리 세대를 설명 하 고 유전자 변형 애기 thaliana 의 집합의 응용 프로그램 세 가지 주요 meristems, 싹 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에는 레이어의 활성화 유도할 수 있는, 조직 관련 식 라인.
Abstract
유도할 수 있는, 조직-특정 식은 유전 섭 동 spatio 시간적 역학을 공부 하는 중요 하 고 강력한 도구입니다. 입증 하 고 벤치마킹 LhGR 시스템 (여기 GR LhG4에 게 불리는) 유도할 수 있는 식에 대 한 시스템을 복제 하는 유연 하 고 효율적인 GreenGate 결합, 우리 생성 집합 유전자 변형 애기는 이펙터의 식을 구동할 수 있습니다. 3 주요 식물 meristems에서 특정 세포 유형의 범위에서 카세트. 이 위해, 우리는 공상 전사 인자와 다양 한 식 수준 이상 꽉 컨트롤을 보장 동족 팝업 형 발기인에 따라 이전 개발 된 GR LhG4 시스템을 선택 했다. 또한, 합성 전사 인자 활성 식 도메인을 시각화 하려면 pOp4 또는 pOp6 발기인의 통제는 응급실 지역화 mTurquoise2 형광 기자는 드라이버 라인에 인코딩됩니다. 여기, 우리는 드라이버 또는 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직 뿌리 정점 분열 조직, 애기의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 단계를 설명 합니다. 사용 하 여 여러 개 또는 모든 드라이버 라인, 하나 표현 컨텍스트 특정 효과 또는 다중 요인 (이펙터) 합성 팝 발기인의 통제 평가 될 수 있다, 예를 들어 한 이펙터 및 다중 사이 십자가의 F1 식물에 드라이버 라인입니다. 이 접근은 VND7, 셀 자율적인 방식으로 소성 2 차 세포 벽 증 착을 유도 할 수 NAC 녹음 방송 요인의 소성 식으로 궁 행.
Introduction
Postgenomic 시대에 생물학에서 주요 한계는 주어진된 요소 또는 유전 섭 동의 컨텍스트 특정 역할을 해독 이다. 기능 손실 및 이득의 기능 접근 등 제정 유전 섭 종종 평생 적응 프로세스, 기본 및 보조 효과 사이 구별을 난독 처리 끝점 분석 허용. 또한, 컨텍스트 특정 기능 마스크 수 또는 먼 조직에 또는 개발의 다른 단계 동안 대규모 효과 의해 희석. 또한, 극단적인 경우에 치 사 율 어떤 기계적 통찰력을 배제 수 있습니다. 이상적으로, 이러한 문제를 회피 한 수 분석 특정 셀 형식과 같은 특정 컨텍스트 내에서 급성 유전 섭 동 효과 시간 해결 방식. 이를 위해, 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 식에 대 한 유전 도구 필요1있습니다. 주어진된 이펙터에 대 한 응답의 spatiotemporal 역학의 급속 한 평가 대 한 리소스를 제공 하 우리는 GR LhG4 시스템3, 의 검증 된 효능 함께 GreenGate 시스템2 에서 제공 하는 복제의 용이성을 결합 4,,56. 우리 잘 특징이 셀 유형 특정 발기인8의 통제 쥐 corticoid 수용 체 (GR)7 의 ligand 바인딩 도메인에 융합 LhG4 공상 전사 요소를 표현 하는 라인의 집합 생성. 조건, 휴식에서 녹음 방송 요인 남아 있다 핵, 외부 GR 도메인 cytosolic HSP90 바인딩됩니다. 더불어 합성 리간드 dexamethasone (덱 스), 핵 전 좌 유도 및 LhG4 mTurquoise2 기자 같은 동족 합성 팝업 형 모터의 통제 식 카세트의 녹음을 중재할 것 이다 유도 후 식 도메인을 시각화 하기 위해 드라이버 라인에 포함. 따라서, 드라이버 라인 기술적으로 또한 포함 한 이펙터 카세트. 따라서, 예를 들어 같은 팝업 형 모터의 통제 관심사의 유전자와 이펙터 카세트를 들고 라인 드라이버 집합의 교차점 허용 이펙터 식의 급성 또는 장기 결과의 급속 한 평가 세포 유형의 다양 한 range.
여기, 우리는 드라이버와 이펙터 라인을 생성 하 고 셀 형식 특정 식을 유도 하 고 촬영 정점 분열 조직, 뿌리 정점 분열 조직에의 레이어의 다음 수 어떻게 설명 하는 데 필요한 절차를 설명 하는 프로토콜 제공 애기입니다. 노하우와이 방법의 특이성을 설명 하기 위해 잘 알려진 전사 인자 VND7 xylem 같은 2 차 세포 벽 thickenings ectopically 운전 수 있는 활용9. 전 칼 집 애기 의 셀 줄기에서 소성 xylem 같은 세포의 형성에 이르게 pSCR10,11 드라이버 선 및 pOp6:VND7 이펙터 선 사이 십자가에서 f 1을 치료.
드라이버 및 이펙터 식 플라스 미드를 구축에 필요한 큰 DNA 어셈블리의 생성을 촉진 하기 위하여 우리는 신속 하 고 효율적인 GreenGate 복제 방법2를 사용 합니다. GreenGate 복제 기반 에코31I 등의 isoschizomer Bsa유형 II S 제한 효소 나2. 이 효소 그들의 비대칭 인식 사이트 기본 구성 변화와 돌출부를 생산의 다운스트림 잘라. 에코31I 통합 /Bsa나 oligonucleotides에 제한 사이트 및 DNA 요소에 특정 오버행 시퀀스 할당, 모듈 복제 달성, 대형 어셈블리의 생성을 촉진. GreenGate 프레임 워크에서 DNA 모듈 어댑터 역할을 하 고 그 순서 대로 조립 오버행 시퀀스를 기반으로 하는 A F 범주로을. 따라서, 원하는 제품을 증폭 위한 뇌관 선택된 모듈2 (그림 1A) 되어야 합니다. 경우는 내부 에코31I /Bsa사이트 및 시퀀스 GreenGate 항목 및 대상 모듈와 호환 되지 않습니다, mutagenizing, 없이 그러나 낮은 효율성으로 진행할 수 있습니다. 또는, 사이트 지시 된 mutagenesis 에코31I 제거를 사용 하 여 /Bsa나 유전자 제품에서 아미노산을 변경 하지 않도록 주의 복용 금지 사이트.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리는 생성 하 고 유도할 수 있는, 세포 유형 특정 트랜스에 대 한 다양 하 고 포괄적인 툴킷 적용 하는 데 필요한 단계를 설명-활성화. 드라이버 라인 팝 발기인의 통제 이펙터 카세트를 들고 경계선을 넘어 다양 한 셀 형식에에서 유전 섭 동의 급속 한 평가 활성화 F1 세대에 잘못 표현 효과 연구 수 있습니다. 또는, 이펙터 구문을 변환 드라이버 라인을 사용할 수 있습니다 또?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리의 실험실에 일은 독일 연구 재단 (DFG)에 의해 지원 보조금 WO 1660/6-1 (남서) 및 GR 2104/4-1 (T.G.) 및 SFB1101 (T.G. J.U.L)를 통합 유럽 연구 위원회에 의해 T.G.를 (PLANTSTEMS 647148)를 부여 남서는 그랜트 WO 1660/2 통해 DFG의에 미 뇌터 교제를 통해 지원 됩니다.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
Riferimenti
- Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. Transactivated and chemically inducible gene expression in plants. The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).
- Lampropoulos, A., et al. GreenGate—a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis. PLoS One. 8 (12), e83043 (2013).
- Baroux, C., et al. Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis. Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).
- Craft, J., et al. New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis. The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).
- Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).
- Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco. The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).
- Picard, D. Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis. Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).
- Schurholz, A. K., et al. A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis. Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).
- Kubo, M., et al. Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation. Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).
- Di Laurenzio, L., et al. The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root. Cell. 86 (3), 423-433 (1996).
- Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot. Development. 127 (3), 595-603 (2000).
- Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).
- Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).
- Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database. Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).
- . Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine Available from: https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html (2018)
- Huang, Y., et al. Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation. PLoS One. 8 (1), e53489 (2013).
- Wallner, E. S., et al. Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation. Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).
- Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems. Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).
- Watanabe, Y., et al. Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls. Science. 350 (6257), 198-203 (2015).
- Yamaguchi, M., et al. VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system. Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).
- Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis. BMC Plant Biology. 5, 9 (2005).
- Aoyama, T., Chua, N. H. A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants. The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).
- Decaestecker, W., et al. CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis. bioRxiv. , (2018).
