Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación
Summary
Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.
Abstract
Expresión inducible, tejidos específicos es una herramienta importante y poderosa para el estudio de la dinámica espacio-temporal de la perturbación genética. Combinando el GreenGate flexible y eficiente con el probada y éxitosos LhGR sistema (aquí denominado GR-LhG4) para la expresión inducible de clonación, hemos generado un conjunto de líneas transgénicas de Arabidopsis que puede conducir a la expresión de una unidad de efectos cassette en una gama de tipos específicos de la célula en los meristems planta principal tres. Para ello, elegimos el sistema GR-LhG4 previamente desarrollado basado en un factor de transcripción quimérica y un promotor de cognado pOp tipo garantizando un control estricto sobre una amplia gama de niveles de expresión. Además, para visualizar el dominio de expresión donde está activo el factor de transcripción sintética, un reportero fluorescente mTurquoise2 ER localizada bajo el control del promotor pOp4 o pOp6 está codificado en líneas de controlador. Aquí, describimos los pasos necesarios para generar una línea de conductor o efectoras y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Mediante conductor varias o todas las líneas, el efecto específico del contexto de expresar uno o varios factores (efectores) bajo control del promotor sintético pOp puede evaluarse rápidamente, por ejemplo en las plantas de la F1 de un cruce entre un generador de efectos y múltiples líneas de controlador. Este enfoque se ejemplifica por la expresión ectópica de VND7, un factor de transcripción NAC capaces de inducir la deposición de pared de célula secundaria ectópico de manera autónoma de la célula.
Introduction
Una limitación importante en biología en la era postgenómica es descifrar el papel específico del contexto de un determinado factor o perturbación genética. Perturbaciones genéticas constitutivas como los enfoques de la función de pérdida y ganancia de función a menudo sólo permiten el análisis de punto final de los procesos de adaptación permanente, ofuscación de la distinción entre efectos primarios y secundarios. Además, funciones específicas de contexto pueden ser enmascaradas o diluidas por efectos de gran escala en los tejidos distantes o durante otras fases del desarrollo. Por otra parte, en casos extremos, la mortalidad puede impedir cualquier idea mecanicista. Idealmente, para evitar estos problemas, uno podría analizar el efecto de perturbación genética aguda dentro de un contexto específico como un tipo de células específicas de una manera tiempo-resolved. Para lograr esto, herramientas genéticas de expresión inducible, de tipo específico de célula son necesarios1. Para proporcionar un recurso para la evaluación rápida de la dinámica espacio-temporal de una respuesta a un determinado efector, hemos combinado la facilidad de clonación proporcionados por el sistema de GreenGate2 con la eficacia probada de la GR-LhG4 sistema3, 4,5,6. Hemos generado un conjunto de líneas que expresan el factor de transcripción quimérica LhG4 fusionados con el dominio de unión de ligando de la rata por corticoides tópicos del receptor (GR)7 bajo el control de la célula bien caracterizado tipo promotores específicos8. En condiciones de reposo, el factor de transcripción permanece fuera del núcleo, como el dominio GR está limitado por la HSP90 citosólica. Con la adición de dexametasona (Dex) de ligando sintético, se induce translocación nuclear y LhG4 se median la transcripción de las cassettes de expresión bajo control de un promotor de cognado sintético tipo pOp , como un reportero de mTurquoise2 dentro de las líneas piloto para visualizar el dominio de la expresión después de la inducción. Así, las líneas de conductor técnico también contienen un casete del efector. El cruce de un conjunto de líneas de conductor con una línea con un casete de efectores con, por ejemplo, un gen de interés bajo el control del mismo tipo de pOp promotor así permite la evaluación rápida de las consecuencias agudas o a largo plazo de la expresión de efector en una amplia gama de tipos celulares.
Presentamos un protocolo que describe los procedimientos necesarios para generar las líneas de controlador y generador de efectos y demostrar cómo expresión específica de tipo celular puede ser inducida y seguida en el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium de Arabidopsis. Para ilustrar la destreza y la especificidad de este enfoque, utilizamos el factor de transcripción conocido VND7 que es capaz de conducir ectopically engrosamientos de pared de célula secundaria de xilema como9. Tratamiento de la F1 de un cruce entre la línea de conductor11 pSCR10,y la línea de efectos de pOp6:VND7 conduce a la formación ectópica xilema-como las células de la vaina de almidón células de Arabidopsis del tallo.
Para facilitar la generación de grandes conjuntos de ADN necesaria para la construcción de plásmidos de expresión controlador y generador de efectos, utilizamos la rápida y eficiente GreenGate clonación método2. Clonación de GreenGate es basado en enzimas de restricción tipo II S como Eco31I o su isoschizomer Bsay2. Estas enzimas cortan río abajo de sus sitios de reconocimiento asimétrica produciendo proyecciones con diferentes composición de base. Mediante la incorporación de Eco31I /Bsasitios de restricción en oligonucleótidos y asignar secuencias de proyección específica para elementos de ADN, clonación modular se obtiene, facilitando la generación de grandes ensamblajes. En el marco de GreenGate, módulos de ADN se dividen en categorías A-F basado en proyección de la secuencia que sirven como adaptadores y se montan en ese orden. Por lo tanto, los cebadores diseñados para amplificar el producto deseado deben ser según el módulo seleccionado2 (figura 1A). Si hay una interna Eco31IBsadel sitio y la secuencia no es compatible con los módulos de entrada y destino de GreenGate, puede continuar sin mutagenizing, pero con menor eficiencia. Como alternativa, utilice mutagénesis sitio-dirigida para quitar Eco31I /Bsasitios de restricción teniendo cuidado de no para cambiar los aminoácidos en los productos del gene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, describimos los pasos necesarios para generar y aplicar una herramienta versátil y completa de células inducibles, tipo específico trans-activación. Cruzando líneas llevar casetes efector bajo control del promotor pOp con líneas controlador permite estudiar los efectos de la expresión errónea en la generación F1, lo que permite la evaluación rápida de perturbación genética en una amplia gama de tipos celulares. Alternativamente, construcciones efector pueden utilizarse para transform…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Trabajo en nuestros laboratorios es apoyado por la Fundación de investigación alemana (DFG) subvenciones WO 1660/6-1 (S.W.) y GR 2104/4-1 (T.G.) y SFB1101 (a T.G. y J.U.L) y por un Consejo de investigación europeo consolidator grant (PLANTSTEMS 647148) a T.G. S.W. es apoyado a través de la beca de Noether del Premio Emmy del DFG a través de subvención WO 1660/2.
Materials
| Ampicillin | Carl Roth GmbH + Co. KG | K029.1 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Column purification | Qiagen | QIAquick PCR Purification Kit (250) | |
| Culture chamber for imaging | Sarstedt AG & Co. KG | 1-well tissue culture chamber, on cover glass II | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4903 | |
| DMSO | Fisher Scientific, UK | D139-1 | |
| Eco31I | Thermo Fisher Scientific | FD0294 | |
| injection cannula (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2) | Sterican, Braun | ||
| Kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG | T832.2 | |
| Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda blue 63x water immersion objectiv | Leica, Wetzlar, Germany | ||
| MS medium | Duchefa, Haarlem, Netherlands | M0221.0050 | |
| Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x 1.1 NA water immersion objective | Nikon, Minato, Tokyo, Japan | ||
| Petri dish 35/10 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 627102 | |
| Petri dish 60/150 mm | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 628102 | |
| Petri dish 120/120/17 | Greiner Bio-One GmbH, Germany | 688102 | |
| Plant agar | Duchefa, Haarlem, Netherlands | P1001 | |
| Plasmid extraction | Qiagen | QIAprep Spin Miniprep Kit | |
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Razorblade | Classic, Wilkinson Sword GmbH | 7005115E | |
| Reaction tubes | Sarstedt AG & Co. KG | 72.690.001 | |
| Silwet L-77 | Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Germany | ||
| Spectinomycin | AppliChem GmbH | 3834.001 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000c | |
| Sucrose | Carl Roth GmbH + Co. KG | 4621.1 | |
| Sulfadiazine | Sigma-Aldrich | S6387 | |
| Tetracycline | AppliChem GmbH | 2228.0025 | |
| T4 Ligase 5 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0011 | |
| T4 Ligase 30 U/µl | Thermo Fisher Scientific | EL0013 |
Riferimenti
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