Summary

神経疾患におけるリピドミクスとトランスクリプトミクス

Published: March 18, 2022
doi:

Summary

この記事では、炎症およびニューロン活性の根底にある脂質、膜脂質、下流メッセンジャー、および脂質機能の根底にあるmRNAコード酵素/受容体を標的とする神経疾患マウスモデルにおける組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクス、および血漿リピドミクスのためのモジュラープロトコルを提示する。サンプリング、サンプル処理、抽出、および定量の手順が概説されています。

Abstract

脂質は、神経学的疾患を助長する脳の侮辱または刺激に対する主要なインターフェースとして機能し、疾患の発症および進行を強調することができる様々なシグナル伝達またはリガンド機能を有する脂質の合成のための貯蔵庫である。多くの場合、未症候性レベルで変化する脂質は、薬物標的およびバイオマーカーの新たな供給源である。多くの神経学的疾患は、神経炎症、神経変性、および神経細胞興奮性を共通の特徴として示し、部分的には特定の脂質シグナル伝達系によって調節される。様々な脂質の合成の相互依存性および相互関係は、神経学的文脈の共通性および特異性を導き出し、疾患の発症および進行の機構的側面の解明を促進するために、多脂質、多酵素、および多受容体分析を促す。脂質の役割を異なる脳領域に帰属させることは、神経学的疾患に関連する脂質分子表現型および形態の決定を前進させる。

ここでは、膜脂質および下流脂質シグナルの分析に適したモジュラープロトコルを、その機能の根底にある酵素およびメディエーターのmRNAとともに、特定の神経学的疾患および/または状態に関連する個別の脳領域から抽出する。正確な比較リピドミープロファイリングを確実にするために、ワークフローと操作基準は、i)関心領域の脳サンプリングと解剖、ii)複数の脂質シグナルと膜脂質の共抽出、iii)二重脂質/mRNA抽出、iv)液体クロマトグラフィー多重反応モニタリング(LC / MRM)による定量、およびv)標準mRNAプロファイリングのために最適化され標準化されました。このワークフローは、機能的に離散的な脳サブ領域のサンプリング(すなわち、脳パンチングによる)によって得られる低組織量に対して順応性であり、したがって、組織の不均一性および/または動物の変動性による多分子分析におけるバイアスを防止する。神経疾患の末梢結果を明らかにし、神経学的疾患状態の翻訳分子読み出しを確立するために、末梢器官サンプリング、プロセシング、およびその後のリピドミクス分析、ならびに血漿リピドミクスも追求され、記述される。このプロトコルは、急性てんかんマウスモデルで実証される。

Introduction

近年の脂質の機能の進歩と神経疾患の発症・進行における脂質の役割は、新たな治療標的や疾患メカニズム解明の新たな研究開発の場を切り拓いています1。質量分析イメージングや高度な質量分析プロファイリングなどの現代の分子イメージング技術によって強調された、異なる脳領域における脂質組成の文書化された違いは、脂質調査のパラダイムを全脳から機能的に別個の脳領域へとシフトさせる。脂質組成が異なる脳領域で変化するという事実は、機能的に異なる脳領域にわたる脳の侮辱または刺激に応答して、膜脂質感受性および下流脂質シグナル伝達の両方の新しい概念化を促す。したがって、脂質プロトコルは、より高い空間分解能の検出および定量化のための低組織量の課題に対処するための新しい開発を必要とし、同時に、細胞膜およびシグナル伝達経路の複数の脂質成分の分析を必要とする。また、それらのレベルおよび機能の調節に関与する酵素、脂質リガンド、および受容体の決定は、神経学的疾患において影響を受けるシグナル伝達経路を解明し、病態生理学的文脈における新しい機構的研究を導くために最も重要である。

脳の空間分解能の向上に加えて、新しい神経リピドミーアプローチの開発に挑戦する2つの大きな困難があります。第1に、脂質シグナル伝達分子は、典型的には、膜構成脂質と比較して非常に低い存在量のものである。第2に、リピドームは高い構造的不均一性を示し、単一の分析アプローチを用いて解剖することは困難である。したがって、抽出および分析方法は、異なる脂質カテゴリーに合わせて調整され、異なる組織サンプルで一般的に実行されます。2.ショットガンリピドミクス法3 膜脂質の広範なプロファイルを迅速に明らかにするための優れたツールであり、標的化された発見および定量化質量分析法によってもたらされる感度および選択性の増加は、i)炎症性脂質およびii)エンドカンナビノイド(eCB)、アミノ酸結合脂質などのニューロン活性の調節に関与する脂質を含む、低豊富シグナル伝達脂質の調査に利用され、 等。4,5.神経学的疾患モデルの脳領域において生じる細胞膜およびシグナル伝達レベルの両方における脂質変化を包含するために、典型的には、脂質抽出および分析は、別個の組織試料において、別個の動物バッチから、または異なる半球から得られ、またはより大きな組織領域を複数の断片に解剖することによって行われる。酵素受容体のmRNAレベルも興味深い場合、それらの調査は通常、別個の組織サンプルの調達を必要とする。例えば、膜脂質、内因性カンナビノイド、およびmRNAの調査には、3つの異なる組織サンプル(例えば、2つの脂質抽出方法(膜脂質およびシグナル伝達脂質)のための2つのサンプル、およびその後の2つの脂質分析方法およびmRNA分析のための1つのサンプル)が必要である。炎症性脂質および内因性カンナビノイドの調査には、それぞれ2つの異なる組織サンプル、抽出方法、および分析方法が必要です。別の例は、脳パンチまたはレーザー微小解剖サンプル中のmRNAおよび脂質カテゴリーの調査であり、その結果、脳(サブ)領域ごとに2つのサンプルを調達するために2つの異なる動物が必要である。このような場合、結果の実質的な程度の変動性および/または再現性の悪さが、生物学的変動性および/または組織の不均一性に起因することが多い。特に脳内で高い空間分解能で起こる多分子分析のこれらの実用的な限界に導かれて、1)LC/MRMによる炎症性脂質(例えば、エイコサノイド(eiCs))およびeCBなどのニューロン活動の調節に関与する脂質の共抽出および共分析を含む3モジュールのニューロリピドミクスプロトコルが設計されました。2;2)リン脂質(PL)とeCBの共抽出とその後のマルチスキャンLC/MRMおよび前駆体/中性損失スキャン分析2;3)膜(リン)脂質およびeCBならびにmRNAの二重抽出、その後のLC/MRMおよびqPCRまたはRNAシーケンシング分析6.神経学的疾患および関心のある脳領域において対処されるべき生物学的問題に応じて、第1および第2のプロトコル、または第1および第3のプロトコルの組み合わせを、約4mgの重さの組織について同じ組織標本に適用することができる。第1および第3のプロトコールは、2mg前後の組織に対して独立して適用することができる。第2のプロトコルは、わずか0.5mgの重さの組織に適用することができる。選択された神経リピドームプロトコルモジュールに関係なく、組織サンプリングおよび前分析処理、脳単離および領域解剖、ならびに動物モデルを犠牲にする手順は、プロトコルの3つのモジュールすべてについて標準化され、同一である。神経学的疾患の調査では、疾患の病理学的結果に関連する末梢器官も常に収集され、これらのモジュラープロトコルを使用して分析されます。さらに、血漿リピドミクスのために血液が定期的にサンプリングされ、将来の翻訳アプリケーションの観点から神経学的疾患の読み出しツールとして機能します。ここで提示されたモジュラーリピドミクスプロトコルは非常に汎用性が高く、より大きな組織量に拡張可能であり、事実上あらゆる組織タイプおよび疾患に容易に適用可能である。モジュラープロトコル(図1)神経学的疾患において、外傷性脳損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、またはてんかんなどの神経学的障害の発症および進行の任意の標準化されたげっ歯類モデルが許容される。

これらのプロトコルは、ヒト側頭葉てんかん(TLE)8,9,10,11に類似しているため、前臨床試験で広く使用されているてんかんのカイニン酸(KA)誘導マウスモデルにおけるてんかんの急性期における組織リピドームおよび/またはトランスクリプトームの変化の研究に広く適用されている2,7これらのプロトコールを用いて、パルミトイルエタノールアミド(PEA)12,13などの薬物の治療可能性を、てんかんの同じマウスモデルにおいて評価した。この研究では、脳および末梢における高分解能および低空間分解能での脂質およびmRNAの変化、最大急性発作強度の時点(発作誘発後60分)、およびKA発作誘発後の4つの異なる時点(20分、60分、120分、および180分)におけるPEAによる亜慢性および急性治療時、てんかんの急性期をカバーする時間窓が同定された。未処理のKA注射マウス、急性および亜慢性PEA処置マウス、ならびにビヒクルおよびPEAビヒクル対照マウスの血漿、脳、および末梢器官を、各時点で収集し1213、およびこの分子分析を用いて調査した。分子データは、急性てんかん期の進行およびそれを緩和するPEAの可能性を解明するために、発作スコアリングによって得られた行動表現型、ならびに神経変性プロセスに関する免疫組織化学由来のデータと相関していた。

Protocol

ここに記載されているすべての実験手順は、2010年9月22日の欧州共同体理事会指令(2010/63EU)に準拠しており、ドイツのラインラントプファルツ州の地元の動物委員会によって承認されました(ファイル参照:23 177-07/G16-1-075)。 1. 急性および予防的に治療されたKA誘発てんかんの動物モデル 発作誘発、治療、および行動スコアリングを実行する。 別々のマウス(1群?…

Representative Results

記載されたプロトコルのセットは、動物モデルの選択、サンプリングの経路、抽出およびプロファイリングの方法など、目的に固有の方法で異なるレベルで組み合わせることができる(図1)。 急性てんかん発作状態の経時変化に伴う脳および末梢の脂質レベル変化を決定し、PEAの潜在的な抗てんかん?…

Discussion

ここで説明する神経リピドミーおよびトランスクリプトーム方法論は、脳および末梢器官におけるあらゆる疾患または健康な発達を高および低空間分解能で調査するための実行可能な手段である。最適化された血漿サンプリングおよび取り扱い手順により、組織リピドミクスおよびトランスクリプトミクスのために屠殺されたのと同じ動物から血漿リピドミクス分析を行うこともできるため?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この記事は、エルメリンダ・ロマッツォ博士に捧げます。この原稿の完成中に、エルメリンダ・ロマッツォ博士が亡くなりました。彼女は科学への情熱と、有意義な研究目的を果たすためのチームワークへの無私の関与の具現化です。彼女は常に人間のより大きな幸福に有意義に貢献することを夢見ていました。彼女の善良な性質は、科学と生命の激しい道によって決して損なわれませんでした。彼女は私たちの心の中で、そして永遠に、かけがえのない存在であり続けるでしょう。

Julia M. Postは、ヨハネス・グーテンベルク大学マインツの大学医療センターのFocus Program for Translational Neuroscience(FTN)から資金提供を受け、現在はLBへのSPP-2225 EXITプロジェクトから資金提供を受けています。これらの研究のための部分的な資金は、リピドミクスコアファシリティ、生理化学研究所、およびヨハネスグーテンベルク大学マインツの大学医療センターから(LBへの)壁内資金によって提供されました。

Materials

12(S)-HETE Biomol Cay10007248-25 Lipid Std
12(S)-HETE-d8 Biomol Cay334570-25 Lipid Std
1200 series LC System Agilent Instrumentation/LCMS
2100 Bioanalyzer Agilent Instrumentation/qPCR
5(S)-HETE-d8 Biomol Cay 334230 Lipid Std
ABI 7300 Real-Time PCR cycler Applied Biosystems Instrumentation/qPCR
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
amber eppendorf tubes Eppendorf Sample Prep.
Analyst 1.6.2 Software AB SCIEX, Darmstadt Software
Analytical balance Mettler Toledo Instrumentation/Sample prep.
Arachidonic Acid-d8 MS Standard Biomol Cay-10007277 Lipid Std
Bessmann Tissue Pulverizer Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) Instrumentation/Sample prep.
Bino Zeiss Microscopy
cleaved Caspase 3 antibody Cellsignaling 9661S Microscopy
Cryostat, Leica CM3050 S Leica Biosystems Instrumentation/Sample prep.
CTC HTC PAL autosampler CTC Analytics AG Instrumentation/LCMS
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 FST 11271-30 Surgical Tools
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) FST 11252-00 Surgical Tools
EDTA 1000 A Röhrchen Kabe Labortechnik 078001 Sample Prep.
EP-1 EconoPump BioRAD 700BR07757 Instrumentation/Sample prep.
Fine Forceps Mirror Finish FST 11412-11 Surgical Tools
Fine Iris Scissors straight sharp FST 14094-11 Surgical Tools
Fine Scissor Tungsten Carbide straight FST 14568-09 Surgical Tools
Iris Spatulae FST 10094-13 Surgical Tools
Kainic acid Abcam ab120100 Epileptic drug
Lipid View software AB SCIEX, Darmstadt Software
LPC 17:0 Avanis Polaris 855676P Lipid Std
LPC 18:0 Avanis Polaris 855775P Lipid Std
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column Phenomenex 00D-4446-B0 Instrumentation/LCMS
Magnifying lamp Maul GmbH Instrumentation/Sample prep.
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% Honeywell 9814920 Solvent/LCMS
Motic Camara Motic Microscopy
MTBE Honeywell 34875-1L Solvent/LCMS
MultiQuant 3.0 quantitation software package AB SCIEX, Darmstadt Software
NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Scientific Instrumentation/qPCR
PA 16:0-18:1 Avanis Polaris 840857P Lipid Std
PA 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1404 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide Biomol Cay90350-100 Lipid Std
Palmitoyl Ethanolamide-d5 Biomol Cay9000573-5 Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 16:0-18:1 Avanis Polaris 850457P Lipid Std
PC 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1004 Lipid Std
PE 16:0-18:1 Avanis Polaris 850757P Lipid Std
PE 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1104 Lipid Std
PG 16:0-18:1 Avanis Polaris 840457P Lipid Std
PG 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1204 Lipid Std
PI 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1504 Lipid Std
Precelleys 24 Peqlab Instrumentation/Sample prep.
Precellys Keramik-Kügelchen Peqlab 91-pcs-ck14p Sample Prep.
Precellys Stahlkugeln 2,8mm Peqlab 91-PCS-MK28P Sample Prep.
Precellys-keramik-kit 1,4 mm VWR 91-PCS-CK14 Sample Prep.
Prostaglandin D2 Biomol Cay 12010 Lipid Std
Prostaglandin D2-d4 Biomol Cay 312010 Lipid Std
Prostaglandin E2 Biomol Cay10007211-1 Lipid Std
Prostaglandin E2-d9 Biomol Cay10581-50 Lipid Std
PS 17:0-14:1 Avanis Polaris LM-1304 Lipid Std
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS AB SCIEX AU111609004 Instrumentation/LCMS
Real Time PCR System Appliert Biosystem Instrumentation/qPCR
Resolvin D1 Biomol Cay10012554-11 Lipid Std
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) Qiagen 79254 Sample Prep.
Security Guard precolumn Phenomenex Instrumentation/LCMS
Shandon coverplates Thermo Fisher 72110017 Microscopy
Shandon slide rack and lid Thermo Fisher 73310017 Microscopy
SM 18:0 Avanis Polaris 860586P Lipid Std
SM d18:1/12:0 Avanis Polaris LM-2312 Lipid Std
Standard Forceps straight Smooth FST 11016-17 Surgical Tools
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern FST 14130-17 Surgical Tools
T3000 Thermocycler Biometra Instrumentation/qPCR
Thromboxane B2 Biomol Cay19030-5 Lipid Std
Thromboxane B2-d4 Biomol Cay319030-25 Lipid Std
Tissue Lyser II Qiagen/ Retsch 12120240804 Instrumentation/Sample prep.
Tissue Tek Sakura Finetek 4583 Microscopy
Toluidinblau Roth 0300.2 Microscopy
Vapotherm Barkey 4004734 Instrumentation/Sample prep.
Wasser LC-MS Chroma Solv VWR 9814920 Solvent/LCMS

Riferimenti

  1. Aronica, E., et al. Neuroinflammatory targets and treatments for epilepsy validated in experimental models. Epilepsia. 58, 27-38 (2017).
  2. Lerner, R., Post, J., Loch, S., Lutz, B., Bindila, L. Targeting brain and peripheral plasticity of the lipidome in acute kainic acid-induced epileptic seizures in mice via quantitative mass spectrometry. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (2), 255-267 (2017).
  3. Schuhmann, K., Almeida, R., Baumert, M., Herzog, R., Bornstein, S. R., Shevchenko, A. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
  4. Puppolo, M., Varma, D., Jansen, S. A. A review of analytical methods for eicosanoids in brain tissue. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 964, 50-64 (2014).
  5. Blewett, A. J., Varma, D., Gilles, T., Libonati, J. R., Jansen, S. A. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry method for the simultaneous determination of 23 eicosanoids. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 46 (4), 653-662 (2008).
  6. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. 59, 283-297 (2017).
  7. Lerner, R., et al. Simultaneous lipidomic and transcriptomic profiling in mouse brain punches of acute epileptic seizure model compared to controls. Journal of Lipid Research. , 1-48 (2018).
  8. Lévesque, M., Avoli, M., Bernard, C. Animal models of temporal lobe epilepsy following systemic chemoconvulsant administration. Journal of Neuroscience Methods. 260, (2016).
  9. Eyo, U. B., Murugan, M., Wu, L. J. Microglia-Neuron Communication in Epilepsy. Glia. 65 (1), 5-18 (2017).
  10. Zhu, J., Zheng, X. Y., Zhang, H. L., Luo, Q. Kainic acid-induced neurodegenerative model: Potentials and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 457079 (2011).
  11. Park, S. H., Sim, Y. B., Kim, C. H., Lee, J. K., Lee, J. H., Suh, H. W. Role of α-CGRP in the regulation of neurotoxic responses induced by kainic acid in mice. Peptides. 44, 158-162 (2013).
  12. Lerner, R., Cuadrado, D. P., Post, J. M., Lutz, B., Bindila, L. Broad lipidomic and transcriptional changes of prophylactic PEA administration in control mice. Frontiers in Neuroscience. 13, 527 (2019).
  13. Post, J. M., et al. Antiepileptogenic Effect of Subchronic Palmitoylethanolamide Treatment in a Mouse Model of Acute Epilepsy. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, (2018).
  14. Schauwecker, P. E., Steward, O. Genetic determinants of susceptibility to excitotoxic cell death: Implications for gene targeting approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (8), 4103-4108 (2002).
  15. Monory, K., et al. The Endocannabinoid System Controls Key Epileptogenic Circuits in the Hippocampus. Neuron. 51 (4), 455-466 (2006).
  16. Konsman, J. P. The mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Psychoneuroendocrinology. 28 (6), (2003).
  17. Spijker, S., Li, K. W. Dissection of Rondent Brain Regions. Neuroproteomics. 57, 13-27 (2011).
  18. Gross, R. W. The evolution of lipidomics through space and time. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (8), 731-739 (2017).
  19. Wang, M., Wang, C., Han, R. H., Han, X. Novel advances in shotgun lipidomics for biology and medicine. Progress in Lipid Research. 61, 83-108 (2016).
  20. Abbott, S. K., et al. An improved high-throughput lipid extraction method for the analysis of human brain lipids. Lipids. 48 (3), 307-318 (2013).
  21. Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).

Play Video

Citazione di questo articolo
Post, J. M., Lerner, R., Schwitter, C., Lutz, B., Lomazzo, E., Bindila, L. Lipidomics and Transcriptomics in Neurological Diseases. J. Vis. Exp. (181), e59423, doi:10.3791/59423 (2022).

View Video