Denne artikkelen presenterer en modulær protokoll for vev lipidomikk og transkripsjonomikk, og plasma lipidomics i nevrologiske sykdom mus modeller rettet mot lipider underliggende betennelse og nevronal aktivitet, membran lipider, nedstrøms budbringere, og mRNA-koding enzymer / reseptorer underliggende lipid funksjon. Prøvetaking, prøvebehandling, ekstraksjon og kvantifiseringsprosedyrer er skissert.
Lipider tjener som det primære grensesnittet til hjerne fornærmelser eller stimuli bidrar til nevrologiske sykdommer og er et reservoar for syntese av lipider med ulike signalering eller ligand funksjon som kan understreke utbruddet og progresjonen av sykdommer. Lipider endrer seg ofte på presymptomatisk nivå, og er en fremvoksende kilde til narkotikamål og biomarkører. Mange nevrologiske sykdommer viser nevroinflammasjon, nevrodegenerasjon og nevronal spenning som vanlige kjennetegn, delvis modulert av spesifikke lipidsignalsystemer. Gjensidig avhengighet og sammenheng mellom syntese av ulike lipider fører til en multilipid, multienzyme og multireseptoranalyse for å utlede fellestrekk og spesifisiteter i nevrologiske sammenhenger og for å fremskynde unravelling av mekanistiske aspekter ved sykdomsde begynnelse og progresjon. Ascribing lipid roller til distinkte hjerneregioner fremmer bestemmelse av lipid molekylær fenotype og morfologi forbundet med en nevrologisk sykdom.
Presentert her er en modulær protokoll egnet for analyse av membranlipider og nedstrøms lipidsignaler sammen med mRNA av enzymer og mediatorer som ligger til grunn for deres funksjonalitet, hentet fra diskrete hjerneregioner som er relevante for en bestemt nevrologisk sykdom og / eller tilstand. For å sikre nøyaktig komparativ lipidomisk profilering ble arbeidsflytene og driftskriteriene optimalisert og standardisert for: i) hjerneprøvetaking og disseksjon av interesseregioner, ii) samtidig utvinning av flere lipidsignaler og membranlipider, iii) dobbel lipid/mRNA-ekstraksjon, iv) kvantifisering ved væskekromatografi multippel reaksjonsovervåking (LC/MRM) og v) standard mRNA-profilering. Denne arbeidsflyten er egnet for de lave vevsmengdene oppnådd ved prøvetaking av de funksjonelt diskrete hjerneunderregionene (dvs. ved hjernestansing), og forhindrer dermed skjevheter i multimolekylær analyse på grunn av vevs heterogenitet og / eller dyrs variasjon. For å avdekke perifere konsekvenser av nevrologiske sykdommer og etablere translasjonelle molekylære avlesninger av nevrologiske sykdomstilstander, perifer organprøvetaking, behandling og deres påfølgende lipidomiske analyse, samt plasma lipidomikk, forfølges og beskrives også. Protokollen er demonstrert på en akutt epilepsimusmodell.
Nylige fremskritt i funksjonen av lipider og deres rolle i utbruddet og progresjonen av nevrologiske sykdommer åpner nye forsknings- og utviklingssteder for nye terapeutiske mål og sykdomsmekanisme belysning1. Dokumenterte forskjeller i lipidsammensetning i ulike hjerneregioner, understreket av moderne molekylære avbildningsteknikker som massespektrometriavbildning og avansert massespektrometriprofilering, skifter paradigmet for lipidundersøkelse fra hele hjernen til funksjonelt distinkte og diskrete hjerneregioner. Det faktum at lipidsammensetning varierer i forskjellige hjerneregioner, fører til ny konseptualisering av både membran lipidfølsomhet og nedstrøms lipidsignalering som svar på en hjerne fornærmelse eller stimuli over de funksjonelt distinkte hjerneregionene. Derfor krever lipidprotokoller nye utviklinger for å løse utfordringen med lave vevsmengder for høyere romlig oppløsningsdeteksjon og kvantifisering, og samtidig analyse av flere lipidkomponenter i cellemembraner og signalveier. Også bestemmelse av enzymer, lipidliginer og reseptorer involvert i regulering av deres nivåer og funksjon er avgjørende for å belyse signalveiene som påvirkes i en nevrologisk sykdom og veilede nye mekanistiske undersøkelser i en patofysiologisk kontekst.
I tillegg til den økte hjernens romlige oppløsning, er det to store vanskeligheter som utfordrer utviklingen av nye nevrolipidomiske tilnærminger. For det første er lipidsignalmolekylene vanligvis av svært lav overflod sammenlignet med membrankonstituerende lipider. For det andre viser lipidomet en høy strukturell heterogenitet, vanskelig å dissekere ved hjelp av en enkelt analytisk tilnærming. Derfor er ekstraksjons- og analysemetoder skreddersydd for ulike lipidkategorier og utføres vanligvis i distinkte vevsprøver2. Hagle lipidomiske metoder3 er gode verktøy for raskt å avdekke en bred profil av membranlipider, mens økt følsomhet og selektivitet gitt av målrettede oppdagelses- og kvantifiseringsmassespektrometriske metoder er kapitalisert for undersøkelse av lave rikelige signalleider, inkludert: i) inflammatoriske lipider og ii) lipider involvert i modulering av nevronal aktivitet, for eksempel endocannabinoider (eCBs), aminosyrekoblede lipider, etc.4,5. For å omfatte lipidforandringer både på cellemembranen og signalnivået som forekommer i hjerneregioner av nevrologiske sykdomsmodeller, utføres vanligvis lipidekstraksjonen og analysen i distinkte vevsprøver, hentet fra forskjellige dyrepartier eller fra forskjellige halvkule, eller ved å dissekere en større vevsregion i flere stykker. Når mRNA-nivåer av enzymreseptorer også er av interesse, krever deres undersøkelse vanligvis anskaffelse av en distinkt vevsprøve. For eksempel vil undersøkelsen av membranlipider, endogene cannabinoider og mRNA kreve tre forskjellige vevsprøver (f.eks. to prøver for de to lipidekstraksjonsmetodene-membranlipider og signalisering av lipider- og påfølgende to lipidanalysemetoder – og en prøve for mRNA-analyse). Undersøkelse av inflammatoriske lipider og endogene cannabinoider krever to distinkte vevsprøver, ekstraksjonsmetoder og analysemetoder. Et annet eksempel er undersøkelsen av mRNA og av enhver lipidkategori i en hjernestans eller lasermikrodesinfeksjonsprøve som følgelig krever to forskjellige dyr for å skaffe to prøver per hjerne (sub)region. I slike tilfeller oppstår det ofte en betydelig grad av variasjon og/eller dårlig reproduserbarhet av resultatene, som stammer fra biologisk variasjon og/eller vevs heterogenitet. Styrt av disse praktiske begrensningene i multimolekylær analyse, som forekommer spesielt ved høy romlig oppløsning i hjernen, ble en tremodulær nevrolipidomisk protokoll designet som omfatter: 1) samtidighet og samanalyse av LC / MRM av inflammatoriske lipider (f.eks. egenkosanoider (eCs)) og lipider involvert i modulering av nevronaktivitet, for eksempel eCBs2; 2) co-utvinning av fosfolipider (PLs) og eCB med påfølgende multiscan LC / MRM og forløper / nøytral tapsskanningsanalyse2; og 3) dobbel ekstraksjon av membran (fosfo)lipider og eCB samt mRNA, med påfølgende LC/MRM og qPCR- eller RNA-sekvenseringsanalyse6. Avhengig av det biologiske spørsmålet som skal tas opp i en nevrologisk sykdom og hjerneregionen av interesse, kan en kombinasjon av den første og den andre protokollen, eller den første og den tredje protokollen, brukes på samme vevsprøve for vev som veier rundt 4 mg. Den første og tredje protokollen kan brukes uavhengig for vev rundt 2 mg. Den andre protokollen kan brukes for vev som veier så lite som 0,5 mg. Uavhengig av den valgte nevrolipidomiske protokollmodulen, er vevsprøvetaking og preanalytisk behandling, hjerneisolasjon og region disseksjon, samt prosedyren for å ofre dyremodellen standardisert og identisk for alle tre modulene i protokollen. I vår undersøkelse av nevrologiske sykdommer samles og analyseres også perifere organer som er relevante for de patologiske konsekvensene av sykdommen ved hjelp av disse modulære protokollene. I tillegg blir blod regelmessig samplet for plasma lipidomikk for å tjene som et avlesningsverktøy for nevrologiske sykdommer med sikte på potensielle translasjonelle applikasjoner. Her presenteres modulær lipidomisk protokoll er svært allsidig: skalerbar til større vevsmengder og lett anvendelig for praktisk talt alle vevstyper og sykdommer. For bruk av modulprotokollen (Figur 1) i nevrologiske sykdommer, er enhver standardisert gnagermodell av utbrudd og progresjon av nevrologiske lidelser, som traumatisk hjerneskade, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom eller epilepsi mottagelig.
Disse protokollene har blitt grundig anvendt for å studere endringer i vev lipidomet og / eller transcriptome i den akutte fasen av epilepsi i kainsyre (KA) -indusert musemodell av epilepsi2,7, en modell som er mye brukt i prekliniske studier på grunn av likheten med human temporal lobe epilepsi (TLE) 8,9,10,11. Ved hjelp av disse protokollene ble det terapeutiske potensialet til legemidler som Palmitoylethanolamide (PEA)12,13 vurdert i samme musemodell av epilepsi. Studien identifiserte lipid- og mRNA-endringer ved høy og lav romlig oppløsning i hjernen og periferien, på tidspunktet for maksimal akutt anfallsintensitet (ved 60 min postseizure induksjon), og ved subkronisk og akutt behandling med PEA ved fire forskjellige tidspunkter (20, 60, 120 og 180 min) etter KA-anfallsinduksjon, et tidsvindu som dekker den akutte fasen av epilepsi. Plasma-, hjerne- og perifere organer av ubehandlede KA-injiserte mus, akutte og subkronisk PEA-behandlede mus, samt kjøretøy- og PEA-kjøretøykontrollmus, ble samlet inn på hvert tidspunkt punkt12,13, og undersøkt med denne molekylære analysen. De molekylære dataene var korrelert med atferdsmessige fenotyper oppnådd ved anfallsscoring, samt med immunhiistokjemi-avledede data om nevrodegenerative prosesser, for å avdekke progresjonen av den akutte epilepsifasen og PEAs potensial til å lindre den.
Den nevrolipidomiske og transkripsjonshemmelige metodikken som er beskrevet her, er et levedyktig middel for å undersøke enhver sykdom eller sunn utvikling ved høy og lav romlig oppløsning i hjernen og perifere organer. På grunn av optimalisert plasma prøvetaking og håndtering prosedyrer, plasma lipidomisk analyse kan også utføres fra de samme dyrene ofret for vev lipidomics og transcriptomics, og dermed forbedre påliteligheten av vev blod molekylære korrelater og biomarkør oppdagelse. Levering av et bredt se…
The authors have nothing to disclose.
Vi dedikerer denne artikkelen til Dr. Ermelinda Lomazzo. Under ferdigstillelsen av dette manuskriptet gikk Dr. Ermelinda Lomazzo bort. Hun er legemliggjørelsen av lidenskap for vitenskap og uselvisk engasjement i teamarbeid for å oppfylle et meningsfylt forskningsformål. Hun drømte alltid om å bidra meningsfullt til menneskers større velvære. Hennes godhjertede natur ble aldri kompromittert av de anstrengende veiene i vitenskap og liv. Hun vil forbli uvurderlig, og for alltid, i våre hjerter.
Julia M. Post ble finansiert av Focus Program for Translational Neuroscience (FTN) ved University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz og er for tiden finansiert av SPP-2225 EXIT-prosjektet til LB. Raissa Lerner ble delvis finansiert av DZHK-prosjektet 81X2600250 til LB og Lipidomics Core Facility. Delvis finansiering av disse studiene ble gitt av Lipidomics Core Facility, Institute of Physiological Chemistry og Intramural funds (til LB) fra University Medical Center ved Johannes Gutenberg University Mainz.
12(S)-HETE | Biomol | Cay10007248-25 | Lipid Std |
12(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay334570-25 | Lipid Std |
1200 series LC System | Agilent | Instrumentation/LCMS | |
2100 Bioanalyzer | Agilent | Instrumentation/qPCR | |
5(S)-HETE-d8 | Biomol | Cay 334230 | Lipid Std |
ABI 7300 Real-Time PCR cycler | Applied Biosystems | Instrumentation/qPCR | |
Acetonitrile LC-MS Chroma Solv | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
amber eppendorf tubes | Eppendorf | Sample Prep. | |
Analyst 1.6.2 Software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
Analytical balance | Mettler Toledo | Instrumentation/Sample prep. | |
Arachidonic Acid-d8 MS Standard | Biomol | Cay-10007277 | Lipid Std |
Bessmann Tissue Pulverizer | Spectrum Laboratories, Inc. (Breda, Netherlands) | Instrumentation/Sample prep. | |
Bino | Zeiss | Microscopy | |
cleaved Caspase 3 antibody | Cellsignaling | 9661S | Microscopy |
Cryostat, Leica CM3050 S | Leica Biosystems | Instrumentation/Sample prep. | |
CTC HTC PAL autosampler | CTC Analytics AG | Instrumentation/LCMS | |
Dumont Curved Forceps Dumoxel #7 | FST | 11271-30 | Surgical Tools |
Dumont Forceps Super fine tip #5SF (x2) | FST | 11252-00 | Surgical Tools |
EDTA 1000 A Röhrchen | Kabe Labortechnik | 078001 | Sample Prep. |
EP-1 EconoPump | BioRAD | 700BR07757 | Instrumentation/Sample prep. |
Fine Forceps Mirror Finish | FST | 11412-11 | Surgical Tools |
Fine Iris Scissors straight sharp | FST | 14094-11 | Surgical Tools |
Fine Scissor Tungsten Carbide straight | FST | 14568-09 | Surgical Tools |
Iris Spatulae | FST | 10094-13 | Surgical Tools |
Kainic acid | Abcam | ab120100 | Epileptic drug |
Lipid View software | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
LPC 17:0 | Avanis Polaris | 855676P | Lipid Std |
LPC 18:0 | Avanis Polaris | 855775P | Lipid Std |
Luna 2,5µm C18(2)- HAST 100A LC column | Phenomenex | 00D-4446-B0 | Instrumentation/LCMS |
Magnifying lamp | Maul GmbH | Instrumentation/Sample prep. | |
Methanol LC-MS Chroma Solv 99.9% | Honeywell | 9814920 | Solvent/LCMS |
Motic Camara | Motic | Microscopy | |
MTBE | Honeywell | 34875-1L | Solvent/LCMS |
MultiQuant 3.0 quantitation software package | AB SCIEX, Darmstadt | Software | |
NanoDrop 2000c Spectrophotometer | Thermo Scientific | Instrumentation/qPCR | |
PA 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840857P | Lipid Std |
PA 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1404 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide | Biomol | Cay90350-100 | Lipid Std |
Palmitoyl Ethanolamide-d5 | Biomol | Cay9000573-5 | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850457P | Lipid Std |
PC 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1004 | Lipid Std |
PE 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 850757P | Lipid Std |
PE 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1104 | Lipid Std |
PG 16:0-18:1 | Avanis Polaris | 840457P | Lipid Std |
PG 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1204 | Lipid Std |
PI 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1504 | Lipid Std |
Precelleys 24 | Peqlab | Instrumentation/Sample prep. | |
Precellys Keramik-Kügelchen | Peqlab | 91-pcs-ck14p | Sample Prep. |
Precellys Stahlkugeln 2,8mm | Peqlab | 91-PCS-MK28P | Sample Prep. |
Precellys-keramik-kit 1,4 mm | VWR | 91-PCS-CK14 | Sample Prep. |
Prostaglandin D2 | Biomol | Cay 12010 | Lipid Std |
Prostaglandin D2-d4 | Biomol | Cay 312010 | Lipid Std |
Prostaglandin E2 | Biomol | Cay10007211-1 | Lipid Std |
Prostaglandin E2-d9 | Biomol | Cay10581-50 | Lipid Std |
PS 17:0-14:1 | Avanis Polaris | LM-1304 | Lipid Std |
Q Trap 5500 triple-quadrupole linear ion trap MS | AB SCIEX | AU111609004 | Instrumentation/LCMS |
Real Time PCR System | Appliert Biosystem | Instrumentation/qPCR | |
Resolvin D1 | Biomol | Cay10012554-11 | Lipid Std |
Rneasy Mini Kit – RNAase-Free DNase Set (50) | Qiagen | 79254 | Sample Prep. |
Security Guard precolumn | Phenomenex | Instrumentation/LCMS | |
Shandon coverplates | Thermo Fisher | 72110017 | Microscopy |
Shandon slide rack and lid | Thermo Fisher | 73310017 | Microscopy |
SM 18:0 | Avanis Polaris | 860586P | Lipid Std |
SM d18:1/12:0 | Avanis Polaris | LM-2312 | Lipid Std |
Standard Forceps straight Smooth | FST | 11016-17 | Surgical Tools |
Surgical Scissor ToughCut Standard Pattern | FST | 14130-17 | Surgical Tools |
T3000 Thermocycler | Biometra | Instrumentation/qPCR | |
Thromboxane B2 | Biomol | Cay19030-5 | Lipid Std |
Thromboxane B2-d4 | Biomol | Cay319030-25 | Lipid Std |
Tissue Lyser II | Qiagen/ Retsch | 12120240804 | Instrumentation/Sample prep. |
Tissue Tek | Sakura Finetek | 4583 | Microscopy |
Toluidinblau | Roth | 0300.2 | Microscopy |
Vapotherm | Barkey | 4004734 | Instrumentation/Sample prep. |
Wasser LC-MS Chroma Solv | VWR | 9814920 | Solvent/LCMS |