순수, odorant 수용 체 odorant 분자 수증기 단계에서 흡입에 의해 활성화 됩니다. 그러나, 대부분의 생체 외에서 시스템 활용 액체 단계 odorant 자극. 여기, 선물이 odorant 자극 기상에 따라 odorant 수용 체 활성화의 실시간 생체 외에서 모니터링 수 방법.
후 각 인식 odorant 수용 체와 odorants의 상호 작용으로 시작 (또는) 후 각 감각 신경 (OSN)에 의해 표현. 냄새 인식 조합 코딩 구성표, 어디 하나 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant ORs의 조합을 활성화할 수 있습니다 다음과 같습니다. 이러한 조합 코딩을 통해 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별 수 있습니다. 따라서, 주어진된 농도에서 냄새는 각 냄새에, ORs의 활성화 패턴으로 설명할 수 있습니다. 그런 의미에서 두뇌를 사용 하 여 냄새 필요 이해 odorant 인식 메커니즘 크래킹-또는 상호 작용. 이 때문에 후각이 지역 사회는 “-orphanize” 이러한 수용 체. 기존의 체 외 시스템 odorant 식별 하는 데 사용-또는 상호 작용 이용 잠복기 셀 미디어 odorant, ORs와 상호 작용 하기 전에 비 강 점 막에 증기 odorants 해산을 통해 냄새의 자연 검색에서 별개입니다. 여기, 우리는 기상 odorants 통해 또는 활성화의 실시간 모니터링을 허용 하는 새로운 방법을 설명 합니다. 우리의 방법은 캠프 릴리스 Glosensor 분석 결과 사용 하 여 발광 측정에 의존 합니다. 그것은 현재 간격 vivo에서 그리고 생체 외에서 접근을 다리 고 biomimetic 휘발성 화학 센서에 대 한 기반을 제공 합니다.
냄새의 감각 지상파 동물을 그들의 휘발성 화학 환경 드라이브 행동과 감정에 작용할 수 있습니다. 근본적으로, 냄새 탐지 과정 odorant 수용 체 (ORs)1의 수준에 후 각 시스템과 odorant 분자의 첫 상호 작용으로 시작 됩니다. 포유류에서 ORs 개별적으로 후 각 감각 신경 (OSNs)2후 각 상피 위치한 표현 됩니다. 그들은 rhodopsin 같은 하위 가족 (클래스 A 라고도 함) 보다 정확 하 게 G-단백질 결합 수용 체 (GPCR) 가족에 속한다. ORs는 물질로 G 단백질 Golf 의 활성화 캠프 생산 주기적인 뉴클레오티드 문을 단 수로의 개통 및 활동 전위의 발생에 이르게 된 커플. 그것은 허용 냄새 percept 활성화 ORs,34 의 특정 패턴에 의존 하 고 따라서 냄새 인식와 조합 코딩 체계, 한 또는 odorants의 세트에 의해 활성화 될 수 있다와 하나의 odorant 활성화할 수 있는 ORs의 조합입니다. 그리고 이러한 조합 코딩을 통해 그것은 가정 하는 생물 감지 하 고 휘발성 냄새 분자의 무수 한 사이 차별. 냄새 인식 하는 방법을 이해 하는 열쇠 중 하나를 이해 하는 방법 및 ORs 주어진된 냄새에 의해 활성화 되는.
Odorant 명료 하 게 하려고-또는 상호 작용, 생체 기능 분석은 필수적인 역할을 했다. 고아 ORs (OR 드 orphanization)에 대 한 길 항 제 향기가 ligands의 식별 다양 한 생체 외에서, 비보, vivo에서 기능 분석 실험5,6,7 전을 통해 지난 20 년간 매우 활성 필드 되었습니다. ,8,9,10,11,12,13,,1415,16, 17.
생체 외에서 분석 결과 시스템은 ORs, 식별 기능 도메인 및 ORs, 잠재적인 엔지니어링 응용 프로그램의 중요 한 잔류물 등의 상세한 기능 특성에 가장 적합. 그러나, 추가 ORs 위한 귀중 한 생체 외에서 시스템의 개발 자란 OSNs와 어려움과 분리 셀에서 ORs의 기능적 표현 때문에 부분에 도전이 되었습니다. 첫 번째 도전 odorant의 매핑 기능 ORs의 세포 표면 표현에 대 한 허용 하는 프로토콜 설정 있 었-또는 상호 작용. 다양 한 접근5,6,7,,89,10,11,12을 활용 하는 독립적인 그룹 수 14,18,,1920. 초기 성과 중 하나는 Krautwurst 그 외 여러분에 의해 만들어진에 N-말단 ORs의 rhodopsin (Rho-태그)의 단축 시퀀스를 태그 하 고 인간 미 발달 신장 (HEK) 셀13에 향상 된 표면 식을 관찰. 유사 또는 시퀀스에 연결 된 태그를 여전히 OR 표현과 기능19,21을 향상을 위한 탐험 경로입니다. 사이토 외. 다음 수용 체 수송 단백질 1 (RTP1) 식별 및 RTP2 OR 매매를 용이 하 게. 22 RTP1, RTP1S, 라는의 짧은 버전 원래 단백질23보다 훨씬 더 효과적인 것으로 표시 되었습니다 또한. 개발 선의 셀 (Hana3A) Golf를 안정적으로 표현, REEP1, RTP1, RTP2 24, 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 기자 들의 사용과 함께 odorant의 활성화-또는 상호 작용. 단백질의 RTP 가족 ORs의 세포 표면 표현 촉진 메커니즘 확인할 수 있다.
이러한 설립된 방법의 하나 주의할 그들이 odorant 자극 액체 단계에서 odorants 자극 매체에 미리 용 해 세포를 자극 하는 매체를 대체 하 여 의미에 의존입니다. 이 생리 적인 조건 odorant 분자 수증기 단계에서 후 각 상피에 도달 하 고 비 강 점 막에 의해 해산 ORs를 활성화 매우 다릅니다. 더 밀접 하 게 닮은 순수 관련 자극 노출, 펠 레 외.20 플라스틱 필름 셀 웰 스 상단에 배치의 내부 얼굴 아래 걸어 odorant 솔루션의 방울을 적용 하 여 증기 자극에 따라 분석 결과 제안. 그들은 형광 강도 모니터링 하 여 칼슘 응답을 기록 했다. 이 메서드는 공기 단계 odorant 자극을 사용 하 여 처음 하지만 또는 활성화의 큰 심사를 허용 하지 않았다.
여기, 우리는 Glosensor 분석 결과 (그림 1)에 의해 증기 위상 odorant 자극을 통해 생체 외에서 또는 활성화의 실시간 모니터링 하는 새로운 방법을 개발 했다. 이 분석 결과 이전 액체 odorant 자극18,19,25,26,,2728,29, 의 맥락에서 사용 되었습니다. 30 , 31. 모니터링 챔버는 루미 노의 플레이트 (그림 1A)를 읽기 전에 증발된 odorant와 equilibrated 처음 이다. Odorant 분자는 버퍼, 관심, RTP1S 및 Glosensor 단백질 (그림 1B) OR을 표현 하는 Hana3A 세포 목욕으로 solvated. odorant or 주 작동 근 이면 OR 전환 활성화 나 란 하 고 바인딩할 Golfadenylyl 있고 (AC), 활성화 되며 궁극적으로 캠프 레벨 상승 원인이. 이 상승 캠프 바인딩할 하 고 발광 소 catalyzing를 생성 하는 Glosensor 단백질을 활성화할 것 이다. 이 발광 다음는 루미 노에 의해 기록 되 고 또는 활성화 모니터링. 이 메서드는 또는 deorphanization의 문맥에 높은 관심의 냄새의 자연 인식에 생체 외에서 시스템 가까이 제공로 서.
냄새의 인식을 근본적으로 ORs의 활성화에 따라 달라 집니다. 따라서, 그들의 기능에 대 한 이해는 뇌의 휘발성 화학 환경 인식에 사용 하는 복잡 한 메커니즘을 깰 필요 합니다. 그러나,이 과정의 이해는 생체 외에서 odorants. 에 대 한 기능 또는 레 퍼 토리에 강력한 방법 수립에 어려움에 의해 방해 되었습니다. 셀 태그 수용 체13,19 의 창조와 발견?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH (DC014423 및 DC016224)와 방위 고급 연구 프로젝트 기관 RealNose 프로젝트에서 교부 금에 의해 지원 되었다. YF 순환 재능 있는 연구원 (R2801)를 가속 화 하기 위해 전략적인 국제 네트워크 발전 위한 JSP 프로그램에서 재정 지원을 가진 듀크 대학에 머물렀다. 우리 감사 Sahar Kaleem 원고 편집.
0.05 % trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C |
100 mm cell culture dish | BD Falcon | 353003 | 100 mm x 20 mm cell culture dish |
15 mL tube | BD Falcon | 352099 | 17 mm x 120 mm conical tubes |
96-well plate | Corning | 3843 | 96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene |
Amphotericin | Gibco | 15290-018 | Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C |
centrifuge machine | Jouan | C312 | Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL |
Class II Type A/B3 fumehood | NUAIRE | NU-407-500 | fumehood for cell culturing |
FBS | Gibco | 16000-044 | Fetal Bovine Serum – store at -20°C |
GloSensor cAMP Reagent | Promega | E1290 | GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C |
Incubator 37 °C; 5 % CO2 | Fisher Scientific | 11-676-604 | Incubator for cell culturing |
Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668-019 | Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C |
Luminometer POLARstar OPTIMA | BMG LABTECH | discontinued | 96 well plate reader for luminescence |
Mineral oil | Sigma | M8410 | Solvent for odorants – store at room temperature |
Minimum Essential Medium (MEM) | Corning cellgro | 10-010-CV | Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C |
Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C |
pGlosensor | Promega | E2301 | pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C |
phase contrast microscope | Leica | 090-131.001 | phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives |
RTP1S | H. Matsunami lab | – | 100 ng/µL plasmid – store at 4°C |