En tiempo real en el seguimiento de Vitro de la activación del Receptor odorante por un olor en la fase de Vapor

Summary

Fisiológicamente, los receptores odorantes son activados por moléculas odorantes inhaladas en la fase de vapor. Sin embargo, más sistemas in vitro utilizan la estimulación olfativa de fase líquida. Aquí, presentamos un método que permite en tiempo real monitoreo in vitro de la activación del receptor odorante al estímulo odorante en fase de vapor.

Abstract

Percepción olfativa comienza con la interacción de olores con los receptores de olor (o) expresados por las neuronas sensoriales olfativas (OSN). Reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. A través de tal codificación combinatoria, organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Así, un olor a una concentración determinada puede ser descrito por un patrón de activación de las RUP, que es específica para cada olor. En ese sentido, se agrieta los mecanismos que el cerebro utiliza para percibir el olor requiere el olor comprensión-interacciones de OR. Por esta razón la comunidad de olfato se ha comprometido a “la orphanize” estos receptores. Sistemas in vitro convencionales usados para identificar el olor- o interacciones han utilizado incubación media de células con olor, que es distinta de la natural detección de olores mediante disolución de Odorantes de vapor en la mucosa nasal antes de interactuar con la SRO. Aquí, describimos un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR por olores fase de vapor. Nuestro método se basa en medir campo liberación por luminiscencia usando el análisis de Glosensor. Puentes actuales brechas entre los métodos in vivo e in vitro y proporciona una base para un sensor químico volátil biomiméticos.

Introduction

El sentido del olfato permite que los animales terrestres interactuar con su ambiente químico volátil para coche comportamientos y emociones. Fundamentalmente, el proceso de detección de olor comienza con la primera interacción de moléculas de olor con el sistema olfativo, en el nivel de odorante receptores (SRO)¹. En los mamíferos, ORs individualmente se expresan en neuronas sensoriales olfativas (OSNs) localizadas en el epitelio olfatorio². Pertenecen a la familia de receptores (GPCR) proteína G acoplada y más precisamente a la subfamilia rhodopsin-como (también llamado clase A). Pareja de SRO con el estimulante G proteínas G_olf cuya activación conduce a campo producción seguido por la apertura de canales de nucleótido cíclico cerrado y la generación de potenciales de acción. Se acepta que el percept de un olor se basa en un patrón específico de ORs activado^3,4 y por lo tanto reconocimiento de olor sigue un esquema de codificación combinatorio, donde uno OR puede ser activado por un conjunto de olores y un odorante puede activar una combinación de ORs. Y a través de tal codificación combinatoria, se postula que los organismos pueden detectar y discriminar entre un gran número de moléculas de olor volátil. Una de las claves para entender cómo se perciben los olores es entender cómo y que ORs son activados por un olor determinado.

En un intento de aclarar olor- o interacciones, ensayos funcionales in vitro han jugado un papel esencial. La identificación de ligandos los agonistas para el huérfano ORs (orphanization de OR) ha sido un campo muy activo durante los últimos veinte años, mediante el uso de vario in vitro, ex vivo e in vivo análisis funcional^{5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

Sistemas de ensayo in vitro son los más adecuados para la caracterización funcional detallada de ORs, incluyendo identificación de los dominios funcionales y residuos críticos de SRO, así como posibles usos de la ingeniería. Sin embargo, más desarrollo de valiosos sistemas in vitro para SRO ha sido un reto, en parte debido a la dificultad de cultivo OSNs y expresión funcional de las RUP en células heterólogas. El primer desafío había sido establecer protocolos que permitían la expresión superficial de la célula de SRO funcional en el mapeo de olor-interacciones de OR. Un número de grupos independientes ha utilizado varios enfoques^{5,6,7,8,9,10,11,12, 14,18,19,20}. Uno de los primeros logros fue hecha por Krautwurst et en la etiqueta el N-terminal de SRO con una secuencia acortada de la rodopsina (Rho-tag) y observó una mejor expresión superficial en células de riñón embrionario humano (HEK)¹³. Variaciones a la etiqueta colocada en la secuencia OR sigue siendo un camino explorado para mejorar OR expresión y funcionalidad de^19,21. Saito et al.. identificado entonces transporte de receptores Proteína 1 (RTP1) y RTP2 que facilitan el tráfico de OR. ²² una versión reducida de RTP1, llamado RTP1S, también ha demostrado ser incluso más eficaz que la proteína original²³. El desarrollo de una línea celular (Hana3A) que expresa estable G_olf, REEP1 y RTP1, RTP2 ²⁴, juntada con el uso de reporteros de monofosfato de adenosina cíclico (campo) ha permitido la identificación de olor-interacciones de OR. El mecanismo por el cual la familia RTP de proteínas promueve la expresión superficial de la célula de ORs queda por determinarse.

Una advertencia de estos métodos establecidos es que cuentan con estímulo odorante en fase líquida, lo que significa que olores se disuelven previamente en un medio de estimulación y estimulan las células mediante la sustitución del medio. Esto es muy distinto de las condiciones fisiológicas donde odorante moléculas alcanzan el epitelio olfatorio en fase de vapor y activan ORs por disolución en la mucosa nasal. Para asemejan más exposición estímulo fisiológico relevantes, Sanz et al.²⁰ propone un análisis basado en la estimulación de vapor aplicando una gota de solución de odorante para colgar debajo de la cara interior de una película plástica colocada en la parte superior de pozos de la célula. Grabaron las respuestas de calcio mediante el control de intensidad de fluorescencia. Este método fue el primero en utilizar la estimulación olfativa de fase de aire, pero que no permitió una proyección grande de la activación de la OR.

Aquí, hemos desarrollado un nuevo método que permite la monitorización en tiempo real de la activación de OR in vitro mediante la estimulación de odorante de fase de vapor por el análisis de Glosensor (figura 1). Este análisis se ha utilizado previamente en el contexto de olor líquido estimulación^{18,19,25,26,27,28,29, 30 , 31}. la cámara de vigilancia de luminómetro primero es equilibrada con aroma vaporizado antes de la placa (figura 1A) de lectura. Las moléculas de olor son entonces solvated en el búfer, bañando las células Hana3A expresan la o de interés, RTP1S y la Glosensor de proteínas (figura 1B). Si el olor es un agonista de la o, o cambiar a una conformación activa y enlazar la G_olf, activación del cyclase del adenylyl (AC) y en última instancia causar los niveles de campo aumenten. Este campo creciente se unen y activan a la proteína de Glosensor para generar luminiscencia catalizando luciferin. Esta luminiscencia es luego registrado por el luminómetro y permite el seguimiento de la activación de OR. Este método es de gran interés en el contexto de deorphanization OR que trae sistemas in vitro más cercano a la percepción natural de los olores.

Protocol

1. Hana3A las células de cultura Preparar M10 (medio esencial mínimo (MEM) más 10% v/v suero fetal bovino (FBS)) y M10PSF (M10 más 100 μg/mL de penicilina-estreptomicina y 1,25 μg/mL anfotericina B). Las células en 10 mL de M10PSF en una placa de cultivo celular de 100 mm en una incubadora a 37 ° C y 5% de dióxido de carbono (CO2) de la cultura. Las células se dividen cada 2 días en una proporción de 20%: cuando la confluencia 100% de las células (aproximadamente 1.1 …

Representative Results

Defendimos la respuesta de tres ORs de ratón, Olfr746, Olfr124 y Olfr1093 utilizando la estimulación de vapor del cinamaldehído (figura 3). Al mismo tiempo, utilizamos un control vector vacío (Rho-pCI) para asegurar que las actividades inducidas por el olor de las RUP probadas fueron específicas (figura 3A). La activación en tiempo real de las RUP a estímulos de olor de vapor fue monitoreada medición de más de 20 ciclos. Los datos para …

Discussion

La percepción del olor es fundamentalmente dependiente de la activación de las RUP. En consecuencia, entendimiento de su funcionalidad es necesaria para romper los complejos mecanismos que utiliza el cerebro para percibir su entorno químico volátil. Sin embargo, la comprensión de este proceso ha sido obstaculizada por las dificultades en el establecimiento de un método robusto para el repertorio de OR para funcionalidad contra olores in vitro. de la pantalla Célula de expresión heteróloga y superficie d…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C