في الوقت الحقيقي رصد المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة بالرائحة في مرحلة البخار

Summary

فسيولوجيا، يتم تنشيط مستقبلات الرائحة من جزيئات الرائحة المستنشقة في مرحلة البخار. ومع ذلك، استخدام معظم النظم في المختبر التحفيز الرائحة الطور السائل. نقدم هنا، أسلوب الذي يسمح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر لتنشيط مستقبلات الرائحة عند التحفيز الرائحة في مرحلة البخار.

Abstract

تصور حاسة الشم تبدأ مع تفاعل أودورانتس مع مستقبلات الرائحة (أو) أعرب عن طريق الخلايا العصبية الحسية حاسة الشم (OSN). ويتبع الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. من خلال هذا الترميز اندماجي، يمكن الكشف عن الكائنات الحية وتميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. وهكذا، يمكن وصف رائحة بتركيز معين عن طريق نمط تنشيط من أملاح الإماهة الفموية، ومحددة لكل رائحة. وبهذا المعني، تكسير الآليات التي يستخدمها الدماغ لإدراك رائحة يتطلب الرائحة فهم-أو التفاعلات. هذا السبب في أن المجتمع أولفاكتيون ملتزمة “دي أورفانيزي” هذه المستقبلات. نظم في المختبر التقليدية المستخدمة لتحديد الرائحة-أو التفاعلات استخدمت تحضين خلية الإعلام مع الرائحة، الذي يختلف عن كشف الروائح عن طريق حل أودورانتس البخار الطبيعي في الغشاء المخاطي للأنف قبل التفاعل مع أملاح الإماهة الفموية. هنا، يمكننا وصف أسلوب جديد يسمح للرصد في الوقت الحقيقي للتنشيط أو عبر مرحلة البخار odorants. لدينا أسلوب يعتمد على قياس الإفراج عن المخيم التﻷلؤ استخدام الإنزيم جلوسينسور. أنه يسد الثغرات الحالية بين النهج المجراة في وفي المختبر، ويوفر أساسا لاستشعار المحاكاة البيولوجية كيميائية المتطايرة.

Introduction

حاسة الشم يسمح الحيوانات البرية للتفاعل مع بيئتها الكيميائية المتطايرة للسلوكيات محرك الأقراص والعواطف. وتبدأ عملية الكشف عن رائحة أساسا، مع تفاعل جزيئات الرائحة الأولى مع نظام حاسة الشم، على مستوى الرائحة مستقبلات (أملاح الإماهة الفموية)¹. في الثدييات، وأملاح الإماهة الفموية فردياً يعبر عن حاسة الشم العصبية الحسية (أوسنس) تقع في حاسة الشم ظهارة². أنها تنتمي لعائلة مستقبلات (GPCR) مقترنة بالبروتين ز وأكثر دقة للأسرة الفرعية مثل رودوبسين (وتسمى أيضا الفئة A). زوجين أملاح الإماهة الفموية وتنشيطية ز البروتين ز_{جبهة تحرير أورومو} التنشيط الذي يؤدي إلى إنتاج المخيم متبوعاً بفتح قنوات دوري النوكليوتيدات بوابات وتوليد إمكانات العمل. من المسلم به أن الإدراك رائحة يعتمد على نمط محدد من أملاح الإماهة الفموية المنشط^3،4 ويترتب على ذلك الاعتراف برائحة مخطط ترميز اندماجي، حيث يمكن تفعيلها أو واحد من مجموعة من أودورانتس والرائحة واحدة يمكن تنشيط مزيج من أملاح الإماهة الفموية. ومن خلال هذا الترميز اندماجي، افترض أن الكائنات الحية يمكن الكشف عن وأن تميز بين عدد وافر جزيئات رائحة متقلبة. واحد من مفاتيح لفهم كيف تعتبر الروائح أن نفهم كيف والذي يتم تنشيط أملاح الإماهة الفموية من رائحة معينة.

في محاولة لتوضيح الرائحة-أو التفاعلات، في المختبر فحوصات فنية لعبت دوراً أساسيا. تم تحديد مؤثر يغاندس معطر لليتيم أملاح الإماهة الفموية (أو دي أورفانيزيشن) حقل نشط جداً طوال السنوات العشرين الماضية، من خلال استخدام مختلف في المختبر، السابقين فيفو والاختبارات الوظيفية المجراة في^{5،6،7 ،،}من^{89،10،11،،}من^{1213،14،15،16، 17}.

نظم الفحص في المختبر الأنسب لتوصيف وظيفي مفصل من أملاح الإماهة الفموية، بما في ذلك تحديد مجالات وظيفية والبقايا الحرجة من أملاح الإماهة الفموية، فضلا عن التطبيقات الهندسية المحتملة. ومع ذلك، كذلك تطوير نظم القيم في المختبر لأملاح الإماهة الفموية قد تحديا، ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة مع أوسنس تثقيف والتعبير الوظيفي من أملاح الإماهة الفموية في خلايا مغايرة. وكان التحدي الأول وضع البروتوكولات التي تسمح بالتعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية الفنية في رسم خرائط للرائحة-أو التفاعلات. وقد استخدمت عددا من المجموعات المستقلة مختلف النهج^5،6،،من^{78،9،10،11،12، 14،18،،}من¹⁹²⁰. أحد إنجازات أقرب كان أدلى بها كروتوورست et al في المعلمة N-المحطة من أملاح الإماهة الفموية مع تسلسل تقصير من رهودوبسن (رو-العلامة) ولاحظ تعبير سطحية محسنة في خلايا الكلي الجنينية البشرية (HEK)¹³. الاختلافات إلى علامة تعلق على التسلسل أو لا يزال مسار البحث لتحسين أو التعبير ووظائف^19،21. سايتو et al. ثم حدد نقل مستقبلات البروتين 1 (RTP1) و RTP2 التي تيسر أو الاتجار. ²² نسخة أقصر من RTP1، يسمى RTP1S، كما تبين أن يكون أكثر فعالية من البروتين الأصلي²³. تطوير خط الخلية (Hana3A) الذي يعرب ستابلي ز_{جبهة تحرير أورومو}، REEP1، RTP1، و RTP2 ²⁴، مقترنة باستخدام الصحفيين دوري الادينوسين الأدينوزين (معسكر) قد مكن تحديد الرائحة-أو التفاعلات. ما زال يتعين تحديد الآلية التي تعزز الأسرة RTP البروتينات التعبير الخلية السطحية من أملاح الإماهة الفموية.

التحذير واحد من هذه الأساليب المتبعة أنها تعتمد على تحفيز الرائحة في الطور السائل، بمعنى أن أودورانتس تذاب مسبقاً إلى وسيلة تحفيز وتنشيط الخلايا بالاستعاضة عن المتوسط. هذا متميز جداً من الظروف الفسيولوجية حيث يصل إلى ظهارة حاسة الشم في مرحلة البخار جزيئات الرائحة وتنشيط أملاح الإماهة الفموية بانحلال في الغشاء المخاطي الأنفي. أكثر شبهاً التعرض الحوافز ذات الصلة الفيزيولوجية، اقترح سانز et al.²⁰ مقايسة استناداً إلى تحفيز البخار بتطبيق قطره حل الرائحة معطلاً تحت الوجه الداخلي للفيلم البلاستيك توضع على رأس الخلية الآبار. أنها سجلت الردود الكالسيوم عن طريق رصد كثافة الأسفار. هذا الأسلوب كان الأول من استخدم الهواء-المرحلة الرائحة التحفيز، ولكن لم تسمح بفرز كبيرة للتنشيط أو.

وهنا، قمنا بتطوير أسلوب جديد يتيح للرصد في الوقت الحقيقي في المختبر أو التنشيط عن طريق حفز الرائحة مرحلة البخار بمقايسة جلوسينسور (الشكل 1). وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا في سياق الرائحة السائل التحفيز^{18،19،25،26،27،،}من^{2829، 30 , 31}-قاعة الرصد لومينوميتير هو اكويليبراتيد أولاً مع الرائحة يتبخر قبل لوحة القراءة (الشكل 1أ). جزيئات الرائحة، ثم ومذاوبة إلى المخزن المؤقت، والاستحمام الخلايا Hana3A التعبير عن أو الفائدة، RTP1S والبروتينات جلوسينسور (الشكل 1ب). إذا كانت الرائحة مؤثر أو، أو سوف التبديل إلى تكيف المنشط وربط مجموعة_{جبهة تحرير أورومو}، تفعيل adenylyl cyclase (AC)، وتسبب في نهاية المطاف إلى ارتفاع مستويات المخيم. سيتم ربط هذا المخيم ارتفاع وتنشيط البروتين جلوسينسور لتوليد التﻷلؤ تحفيز لوسيفرين. ثم يتم تسجيلها لومينوميتير هذا التﻷلؤ ويتيح رصد أو التنشيط. هذا الأسلوب لفائدة عالية في سياق ديورفانيزيشن أو أنه يجلب في المختبر أنظمة أقرب إلى تصور الطبيعية من الروائح الكريهة.

Protocol

1-Hana3A خلايا الثقافة إعداد M10 (الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (MEM) زائد 10% v/v مصل الدم البقري الجنين (FBS)) و M10PSF (M10 بالإضافة إلى 100 ميكروغرام/مل البنسلين-ستربتوميسين و 1.25 ميكروغرام/مل الامفوتريسين ب). ثقافة الخلايا في 10 مل M10PSF في صحن ثقافة خلية 100 ملم في حاضنة في غاز ثاني أكسيد الكربون (CO<su…

Representative Results

نحن فحص الاستجابة لثلاثة من الماوس أملاح الإماهة الفموية و Olfr746 و Olfr124 و Olfr1093 باستخدام سينمالدهيد بخار التحفيز (الشكل 3). في نفس الوقت، كنا ناقلات فارغة (رو-pCI) لضمان أن الأنشطة المستحثة بالرائحة من أملاح الإماهة الفموية اختبارها كانت محددة (الشكل 3أ)….

Discussion

الإحساس برائحة تعتمد اعتماداً أساسيا على التفعيل لأملاح الإماهة الفموية. ونتيجة لذلك، فهم وظيفة كل منها مطلوب للقضاء الآليات المعقدة التي تستخدم الدماغ لإدراك بيئتها الكيميائية المتطايرة. ومع ذلك، قد أعاق فهم هذه العملية الصعوبات في إنشاء وسيلة قوية الشاشة أو مرجع للحصول على وظائف ضد أو…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C