Gerçek zamanlı olarak buharı aşamasında propil reseptör etkinleştirme bir propil tarafından in Vitro izlenmesi

Summary

Fizyolojik açıdan, propil reseptörleri buharı aşamasında inhale propil moleküller tarafından etkinleştirilir. Ancak, en tüp bebek sistemleri sıvı faz propil stimülasyon yararlanmak. Burada, propil reseptör etkinleştirme propil stimülasyon buharı faz üzerine gerçek zamanlı tüp bebek izleme sağlayan bir yöntem mevcut.

Abstract

Koku algı odorants etkileşim propil reseptörleri ile başlar (veya) koku duyusal sinir hücreleri tarafından (OSN) dile getirdi. Koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile etkinleştirilebilir ve bir propil ORs bir arada etkinleştirebilirsiniz bir birleşimsel kodlama düzeni izler. Böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayırımcılık. Böylece, belirli bir konsantrasyon, bir koku ORs, tarafından bir harekete geçirmek desen her koku için belirli olan tanımlanabilir. Bu anlamda, koku gerektirir anlayış propil algıladıkları için beyin kullandığı düzeneklerini çatlama-OR etkileşimleri. Bu yüzden koku alma toplum “Bu reseptörleri de-orphanize için” taahhüt eder. Propil tanımlamak için kullanılan geleneksel tüp bebek sistemleri- veya etkileşimler ORs ile etkileşim daha önce doğal algılama kokuları buharı odorants dağılması ile burun mukozası içine sorumluluk alanlarından olan hücre ortamla kuluçka propil, kullanılan. Burada, OR etkinleştirme buharı fazlı odorants üzerinden gerçek zamanlı izlenmesi için izin yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim yöntem Glosensor tahlil kullanarak ışıldama tarafından kamp yayın ölçme üzerinde dayanır. İçinde vivo ve tüp bebek yaklaşımlar arasındaki geçerli boşlukları arasında köprü görevi gören ve bir biomimetic uçucu kimyasal duyumsal için bir temel sağlar.

Introduction

Koku alma duygusu karasal hayvanlar uçucu kimyasal çevreleri sürücü davranışları ve duyguları ile etkileşimine izin verir. Temelde, koku alma sistemi, propil reseptörleri (ORs)¹düzeyinde ilk etkileşim propil moleküllerin koku Algılama işlemi başlar. Memelilerde, ORs tek tek koku epitel²‘ de yer alan koku duyusal nöronlar (OSNs) ifade edilir. Ait oldukları G-protein birleştiğinde reseptör (GPCR) ailesi ve daha doğrusu rhodopsin benzeri alt aile (sınıf A olarak da bilinir). ORs çift kimin harekete geçirmek ardından döngüsel nükleotit geçişli kanal açılması ve aksiyon potansiyelleri nesil kamp üretim yol açan uyarıcı G protein G_olf ile. Bir koku algılama etkinleştirilmiş ORs^3,4 belirli bir desen kullanır ve bu nedenle koku tanıma nerede bir OR odorants bir dizi ile aktif ve bir propil etkinleştirmek bir birleşimsel kodlama düzeni izler kabul edilen bir ORs birleşimi. Ve böyle Kombinatorik kodlama aracılığıyla, bu organizmalar algılayabilir ve sayısız uçucu koku molekülleri arasında ayrımcılık öne ise. Bir kokuları nasıl algılandığını anlamak için anahtar olduğunu anlamak için nasıl ve hangi ORs tarafından verilen bir koku harekete geçirmek.

Bir girişim propil aydınlatmak için- veya etkileşimler, tüp bebek fonksiyonel deneyleri önemli bir rol oynamıştır. Yetim ORs (OR de-orphanization) için agonist kokulu ligandlar tanımlaması çok aktif bir alan son yirmi yıldır, ex vivo ve içinde vivo işlevsel testleri^{5,6,7 tüp bebek, çeşitli aracılığıyla olmuştur ,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 17}.

İn vitro tahlil sistemleri en iyi ORs işlevsel etki alanları ve kritik artıkları ORs yanı sıra potansiyel mühendislik uygulamaları da dahil olmak üzere, ayrıntılı fonksiyonel karakterizasyonu için uygundur. Ancak, daha fazla değerli tüp bebek sistemlerinin geliştirilmesi için ORs kodlamayla OSNs ile zorluk ve kapaklı hücrelerdeki ORs işlev ifadesi nedeniyle kısmen bir mücadele vardı. İlk challenge propil haritalama işlevsel ORs hücre yüzey ifade için izin iletişim kuralları kurmak için olmuştu-OR etkileşimleri. Bir dizi bağımsız gruplar çeşitli yaklaşımlar^{5,6,7,8,9,10,11,12kullanılan, 14,18,19,20}. En erken başarılarından Krautwurst vd tarafından yapıldı ın rhodopsin (Rho-etiket) kısaltılmış bir dizi ile N-terminus, ORs öğesini ve geliştirilmiş yüzey ifade insan embriyonik böbrek (HEK) hücreleri¹³‘ te görülmektedir. Varyasyonları OR dizisine bağlı etiketi için yapılan olduğunu hala bir yol OR ifade ve işlevselliği^19,21artırmak için araştırdı. Saito ve ark. sonra teşhis reseptör taşıma proteini 1 (RTP1) ve OR ticareti kolaylaştırmak RTP2. ²² RTP1, RTP1S, olarak adlandırılan daha kısa bir sürümünü de özgün protein²³daha da etkili olduğu gösterilmiştir. Geliştirme stabil G_olfifade bir hücre satırı (Hana3A), siklik adenozin monofosfattır (kampı) gazetecilere kullanımı ile birleştiğinde REEP1, RTP1 ve RTP2 ²⁴, propil tanımlaması sağladı-OR etkileşimleri. Hangi RTP aile proteinlerin hücre yüzey ifade belirlenecek ORs kalıntılarının teşvik mekanizması.

Kurulan bu yöntemlerin bir uyarı onlar odorants bir stimülasyon orta önceden çözülür ve orta değiştirerek hücreleri uyarmak anlamında propil stimülasyon sıvı faz, güvenmek olduğunu. Bu fizyolojik şartlarda nerede propil molekülleri koku epitel buharı aşamasında ulaşmak ve ORs dağılması tarafından nazal mukoza etkinleştirmek çok farklıdır. Daha yakından benzer fizyolojik ilgili uyarıcı pozlama, Sanz vd.²⁰ altında hücre kuyu üstüne yerleştirilen bir plastik film iç yüzü asmaya propil çözüm bir damla uygulayarak buharı stimülasyon üzerinde dayalı bir tahlil evlenme teklif etti. Onlar kalsiyum yanıt floresan yoğunluğu izleme tarafından kaydedildi. Bu yöntem ilk hava fazlı propil stimülasyon kullanın, ama OR harekete geçirmek büyük bir tarama izin vermedi.

Burada, gerçek zamanlı buharı faz propil stimülasyon ile tüp bebek OR etkinleştirme Glosensor assay (şekil 1) tarafından izlenmesi sağlar yeni bir yöntem geliştirdi. Bu tahlil daha önce sıvı propil stimülasyon^{18,19,25,26,27,28,29,} bağlamında kullanılan ^{30 , 31}. luminometer izleme odası ilk plaka (şekil 1A) okuma önce buharlaşmış propil ile equilibrated. Propil moleküllerdir sonra faiz, RTP1S ve Glosensor proteinler (şekil 1B) OR ifade Hana3A hücreleri banyo arabellek içine solvated. Propil bir agonist or ise, OR için aktif bir uyum geçin ve gozlemler cyclase (AC) aktive G_olf, bağlama ve sonuçta kamp düzeyleri yükselmeye neden. Yükselen bu kampı bağlamak ve Glosensor protein biyoluminesans katalizlerler ışıma oluşturmak için harekete geçirmek. Bu ışıma sonra luminometer tarafından kaydedilir ve OR etkinleştirme izleme sağlar. Tüp Bebek sistemleri yakınlaştırmayı kokular doğal algı getiriyor gibi yüksek faiz OR deorphanization bağlamında bu yöntem kullanılabilir.

Protocol

1. Hana3A kültür hücreleri M10 hazırlayın (en az önemli orta (MEM) artı % 10 v/v fetal sığır serum (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 µg/mL penisilin-streptomisin ve 1,25 µg/mL Amfoterisin B). M10PSF 100 mm hücre kültür bulaşık kuluçka 37 ° C ve % 5 karbon dioksit (CO2) ayarla içinde içinde 10 mL hücrelerde kültür. 2 günde % 20 oranında Hücreleri Böl: % 100 izdiham hücre (yaklaşık 1.1 x 107 hücreleri) faz kontrast mikroskop altında gözlene…

Representative Results

Yanıt üç fare ORs, Olfr746, Olfr124 ve Olfr1093 ekranlı cinnamaldehyde buharı stimülasyon (şekil 3) kullanarak. Aynı anda, biz test ORs propil kaynaklı faaliyetlerinin belirli sağlamak için bir boş vektör kontrolü (Rho-PCI) kullanılan (şekil 3A). ORs buharı propil uyarıcı üzerine gerçek zamanlı etkinleştirme izlenen 20’den fazla ölçüm devir oldu. Her veri de ilk boş vektör kontrolü ortalama değerine her çevriminde …

Discussion

Koku algı temelde ORs etkinleştirme üzerinde bağlıdır. Sonuç olarak, anlayış işlevleriyle beyin kullanın uçucu kimyasal çevresine algıladıkları için karmaşık mekanizmaları çatlamak için gereklidir. Ancak, bu işlem anlayış tarafından OR repertuar odorants tüp bebek. karşı işlevsellik için ekran için sağlam bir yöntem oluşturulmasında zorluklar engel Hücre ORs yüzey ve kapaklı ifade kısmen çözüldü etiketli reseptörleri^13,<sup class="xr…

Materials

0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054	0.05% Trypsin – EDTA (1x), phenol red – store at 4°C
100 mm cell culture dish	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm cell culture dish
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm conical tubes
96-well plate	Corning	3843	96 well, with LE lid white with clear bottom Poly-D-lysine coated Polystyrene
Amphotericin	Gibco	15290-018	Amphotericin B 250 µg/mL – store at 4°C
centrifuge machine	Jouan	C312	Centrifuge machine with swinging bucket rotor for 15 mL
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE	NU-407-500	fumehood for cell culturing
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Bovine Serum – store at -20°C
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reagent luminescent protein substrate – store at -20°C
Incubator 37 °C; 5 % CO2	Fisher Scientific	11-676-604	Incubator for cell culturing
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reagent 1mg/ml transfection reagent – store at 4°C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	discontinued	96 well plate reader for luminescence
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants – store at room temperature
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Minimum Essential Medium Eagle with Earle’s salts & L-glutamine – store at 4°C
Penicillin/Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	Penicillin-Streptomycin solution stabilized with 10,000 U of penicillin and 10 mg streptomycin – store at -20°C
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP luminescent protein plasmid – store at 4°C
phase contrast microscope	Leica	090-131.001	phase contrast microscope with x4, x10, x20 objectives
RTP1S	H. Matsunami lab	–	100 ng/µL plasmid – store at 4°C