Évaluation de la multiplicité synaptique à l’aide de Patch-clamp de la cellule entière électrophysiologie
Summary
Nous présentons ici un protocole permettant d’évaluer la multiplicité synaptique fonctionnelle à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë.
Abstract
Dans le système nerveux central, une paire de neurones forment souvent des multiples contacts synaptiques et/ou sites de libération neurotransmetteur fonctionnelle (multiplicité synaptique). Multiplicité synaptique est plastique et change au cours du développement et dans les conditions physiologiques différentes, étant un facteur déterminant pour l’efficacité de la transmission synaptique. Ici, nous exposons les expériences pour estimer le degré de multiplicité des synapses se terminant sur un neurone postsynaptique donné à l’aide d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp en tranches cérébrale aiguë. Plus précisément, enregistrement de voltage clamp est utilisé pour comparer la différence entre l’amplitude des courants postsynaptiques excitateurs spontanées (sEPSCs) et les courants postsynaptiques excitateurs miniature (mEPSCs). La théorie derrière cette méthode est que des entrées afférentes qui présentent une multiplicité montrera sEPSCs grande, dépendante du potentiel d’action en raison de la sortie synchrone qui survient à chaque contact synaptique. En revanche, libération de potentiel d’action indépendante (qui est asynchrone) générera plus petite amplitude mEPSCs. Cet article décrit un ensemble d’expériences et d’analyses pour caractériser l’existence d’une multiplicité synaptique et traite les exigences et les limites de la technique. Cette technique peut être appliquée afin d’étudier comment différentes interventions comportementales, pharmacologiques ou environnementales en vivo affectent l’organisation des contacts synaptiques dans certaines zones du cerveau différentes.
Introduction
La transmission synaptique est un mécanisme fondamental pour la communication entre les neurones et donc fonction du cerveau. La transmission synaptique est aussi labile et peut changer son efficacité de manière dépendante de l’activité ainsi qu’en réponse à des signaux modulatory1. Ainsi, l’examen de la fonction synaptique a été un thème majeur de la recherche en neurosciences. Cellule entière patch clamp électrophysiologie est une technique polyvalente qui permet de comprendre, de concevoir des modèles expérimentaux et analyses de données, des mécanismes biophysiques et moléculaires approfondies de la transmission synaptique. Une approche couramment utilisée, peut-être en raison de la simplicité de la technique et le concept, est la mesure de courants postsynaptiques excitateurs/inhibiteur miniature (mE / CISP) sous la tension de la pince configuration2,3, 4 , 5 , 6. MPSC individuels représente le flux d’ions à travers des récepteurs ionotropiques postsynaptique (par exemple les récepteurs AMPA et GABAA ) en réponse à la fixation de leurs respectifs neurotransmetteurs libérés de la terminaison présynaptique 7 . Parce que l’enregistrement est obtenu en présence de la voltage-dépendants Na+ canal bloqueur tétrodotoxine (TTX), la libération est indépendant du potentiel d’action et comporte normalement une seule Vésicule synaptique qui contient des neurotransmetteurs. Selon cette hypothèse, l’amplitude moyenne du MPSC est employé couramment comme une estimation brute pour la taille quantique, qui représente le nombre et la fonctionnalité de récepteurs post-synaptiques s’opposant à un site de sortie du single. En revanche, la fréquence de la MPSC est considéré comme une combinaison du nombre de synapses se terminant sur la cellule postsynaptique et leur probabilité de sortie moyenne. Cependant, ces paramètres ne mesurent pas une autre variable-multiplicativity des synapses ou multiplicité synaptique — qui est important pour l’efficacité de la transmission synaptique.
Basé sur la théorie quantique de la transmission synaptique7,8,9, la force d’une connexion donnée entre une paire de neurones est tributaire de trois facteurs : le nombre de synapses fonctionnelles (N), le postsynaptique réaction à la publication d’une seule Vésicule synaptique (taille quantique ; Q) et la probabilité de la libération des neurotransmetteurs (P,r). Multiplicité de synaptique est équivalente à N. Le développement de la multiplicité synaptique ou l’élagage des synapses multiplicatifs est en plastique tout au long de l’élaboration et la maladie différents États3,4,6,10. Pour cette raison, caractérisant la multiplicité synaptique a des implications importantes pour la compréhension de l’efficacité de la transmission synaptique dans la santé et la maladie. Techniques, telles que la microscopie électronique peuvent d’identifier des preuves de structure synaptique multiplicité en détectant des contacts synaptiques multiples provenant de l’axone même sur le même neurone postsynaptique11,12, 13,14. Cependant, ces multisynapses structurellement identifiés peuvent être fonctionnellement silencieux15,16. Examen fonctionnel précis de N exige techniquement difficile des approches électrophysiologiques, tels que les enregistrements de cellules entières paires qui peuvent déterminer si une connexion donnée a plusieurs sites de rejet fonctionnelle et minimal approches de stimulation qui visent à recruter un seul axone putatif.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple pour estimer la multiplicité synaptique en adoptant une méthode développée initialement par Hsia et al.,2. Cette technique consiste à mesurer la spontanée PSC (SLES SSP) et MPSC à l’aide d’électrophysiologie de cellules entières patch clamp, qui nous permet d’estimer le degré de multiplicité synaptique parmi toutes les entrées d’un neurone donné. Tel que définie précédemment, synaptique multiplicité reflète le nombre de synapses entre un neurone donné en pré- et post-synaptiques. Si plusieurs synapses sont recrutés en même temps par un potentiel d’action, il y aura une forte probabilité de sommation temporelle des différents SSP (i.e. quantique), générant une plus grande amplitude CFP. Dans les enregistrements de la mPSC (dans quels potentiels d’action sont bloqués par TTX), il est peu probable de sommation temporelle des individuels MPSC (non-synchrone). À l’aide de ce raisonnement, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude sPSC (avec libération de potentiel d’action-dépendante) à l’amplitude de la mPSC.
Pour déterminer l’existence d’une multiplicité, les auteurs décrivent quatre expériences et leurs analyses utilisant glutamatergique EPSCs comme exemple. Cependant, la même approche peut être utilisée pour le jeûne transmission GABAergique/glycinergic (CISP). Une brève justification de chaque expérience est décrite ci-dessous. Tout d’abord, comme expliqué ci-dessus, multiplicité synaptique peut être estimée en comparant l’amplitude de sEPSCs à mEPSCs. Il existe deux conditions pour cette approche ; 1) présynaptiques axones doivent avoir un nombre suffisant de potentiels d’action pendant l’enregistrement, et 2) Pr doit être grande pour que plusieurs synapses libération neurotransmetteur à l’arrivée d’un potentiel d’action. Afin de répondre à ces exigences, sEPSCs sont pour la première fois en bas Ca2 + artificiel liquide céphalo-rachidien (aCSF) et ensuite enregistrées en présence d’une faible concentration de l’antagoniste des canaux K+ , 4-Aminopyridine (4-AP) pour augmenter l’action potentiel de tir et Pr. Puis, potentiel d’action tir est bloquée par la TTX et Pr diminué par un voltage-dépendants Ca2 + bloqueur des canaux Cd2 +. L’amplitude de sEPSCs (avec 4AP) est comparée à celle de Cpsem (avec 4AP, TTX et Cd2 +). Dans la seconde expérience, Ca2 + est remplacé par équimolaire Sr2 + dans le FSCA pour désynchroniser la libération des vésicules. Comme Ca2 + est nécessaire pour la version synchrone de vésicules, remplacement avec Sr2 + devrait éliminer le sEPSCs de grande amplitude qui témoignent de la multiplicité. En troisième lieu, mécaniquement, c’est la multiplicité peut résulter de multiples contacts synaptiques au même neurone postsynaptique ou libération multivésiculaires (c’est-à-dire plusieurs vésicules libérés au sein d’un même contact synaptique)17,18. Pour différencier les deux types de la multiplicité, la troisième expérience utilise une faible affinité, rapide dissociation antagoniste compétitif des récepteurs AMPA, γ-D-glutamylglycine (γ-DGG)17,18 , afin de déterminer si grand sEPSC sont le résultat de la sommation temporelle des synapses indépendants ou libération multivésiculaires agissant sur une population qui se chevauchent de récepteurs post-synaptiques. Si les événements de grande amplitude résultent de la dissémination multivésiculaires, γ-DGG sera moins efficace pour inhiber les plus sEPSCs par rapport aux plus petits, tandis que le grand sEPSCs qui découlent de la sommation temporelle de plusieurs contacts synaptiques seront affectés de la même manière par Γ-DGG. Dans la quatrième expérience, une méthode plus physiologique est utilisée pour renforcer le potentiel d’action tir, à savoir afférente stimulation synaptique. Rafales de l’activité synaptique peuvent transitoirement augmentation/faciliter la probabilité de mise à feu et de la libération de potentiel d’action spontanée des afférences stimulées. Par conséquent, cette approche permet de multiplicité de manifester d’une manière plus physiologique.
Le protocole suivant décrit la méthode pour mener ces expériences en tissu hypothalamique de souris. Plus précisément, corticotropin libérant l’hormone (CRH) des neurones du noyau paraventriculaire de l’hypothalamus (PVN) sont utilisés. Nous décrivons les procédures pour la conduite d’électrophysiologie de germes entiers patch clamp et expliquer les expériences spécifiques pour tester la multiplicité synaptique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une condition importante pour une expérience d’électrophysiologie de pince patch réussie est d’obtenir des tranches/cellules saines. Notre protocole décrit est optimisé pour les tranches hypothalamiques qui contiennent les neurones PVN. Autre cerveau peuvent exiger des zones modifiées solutions et méthodes tranchage21,22,23,24. Pour l’enregistrement, il est essentiel pour n’accep…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
J.S. a reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario. W.I. a reçu une nouvelle bourse de chercheur de recherche en santé mentale du Canada. Ce travail est soutenu par les subventions de fonctionnement à Florian de Sciences naturelles et génie conseil de recherches du Canada (06106-2015 RGPIN) et l’Institut canadien de recherche en santé (PJT 148707).
Materials
| 1 ml syringe | BD | 309659 | |
| 10 blade | Fisher Scientific/others | 35698 | |
| 22 blade | VWR/others | 21909-626 | |
| 22 uM syringe filters | Milipore | 09-719-000 | |
| Adson foreceps | Harvard Instruments | 72-8547 | |
| Angled sharp scissors | Harvard Instruments | 72-8437 | |
| Clampex | Molecular Devices | pClamp 10 | |
| Double edge blade | VWR | 74-0002 | |
| Filter paper | Sigma/others | 1001090 | |
| Fine paintbrush | Fisher/various | 15-183-35/various | |
| Gas Dispersion Tube | VWR | LG-8680-120 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi/others | M60303 | |
| Krazy glue | various | various | |
| Mini analysis | Synaptosoft | MiniAnalysis 6 | |
| Osmomoter | Wescor Inc | Model 5600 | |
| Parafilm | Sigma | PM-996 | |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-200 | |
| ph meter | Mettler Toledo | FE20-ATC | |
| Rubber bulb | VWR | 82024-550 | |
| Scalpel handle No. 3 | Harvard Instruments | 72-8350 | |
| Scalpel handle No. 4 | Harvard Instruments | 72-8356 | |
| Single edge blade | VWR | 55411-050 | |
| Vibratome slicer | Leica | VT1200S | |
| Water Purification System | Millipore | Milli-Q Academic A10 | |
| Well plate lid | Fisher/various | 07-201-590/various | |
| Chemicals/reagents | |||
| 4-AP | Sigma | 275875 | |
| BAPTA | molecular probes | B1204 | |
| CaCl2*2H2O | Sigma | C7902 | |
| CdCl2 | sigma | 202908 | |
| DNQX | Tocris | 189 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| glucose | Sigma | G5767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| K2-ATP | Sigma | A8937 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| K-gluconate | Sigma | G4500 | |
| MgCl2*6H2O | Sigma | M2670 | |
| Molecular biology grade water | Sigma | W4502-1L | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| Na-gluconate | Sigma | S2054 | |
| NaH2PO4 | Sigma | 71504 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| Picrotoxin | sigma | P1675 | |
| SrCl | Sigma | 255521 | |
| sucrose | Bioshop | SUC507.1 | |
| TTX | Alamone Labs | T-550 | |
| yDGG | Tocris | 6729-55-1 |
Riferimenti
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