Ein fortgeschrittenes Murine-Modell für alkoholfreie Steatohepatitis in Verbindung mit Typ-2-Diabetes
Summary
Es wird ein einfaches und zuverlässiges, diächterinduziertes Zäuntiermodell für alkoholfreie Steatohepatitis (NASH) beschrieben, das durch das nicht-SPF-Gehäuse der Tiere und die Verabreichung einer bestimmten fettreichen Ernährung erreicht wird. Wir beschreiben die Identifizierung von Leber-und Fettzell-Subsets, um die menschlichen Immunbedingungen zu rekapitulieren, indem Mäuse Umweltkeimen aussetzen.
Abstract
Fettleibigkeit wird mit chronischen, minderwertigen Entzündungen und Insulinresistenz in Verbindung gebracht, was zu einer zunehmenden Prävalenz chronischer Stoffwechselerkrankungen wie Typ-2-Diabetes und alkoholfreier Steatohepatitis (NASH) beiträgt. Neuere Forschungen haben ergeben, dass entzündungshemmende Immunzellen fettleibiges hypertrophisches Fettgewebe und Leber infiltrieren. Angesichts der sich abzeichnenden Bedeutung von Immunzellen im Zusammenhang mit der metabolischen Homöostase ist es dringend erforderlich, ihre Veränderung bei der Entwicklung von Typ-2-Diabetes und NASH zu quantifizieren und zu charakterisieren. Tiermodelle, die für die menschliche NASH typische pathophysiologische Merkmale hervorrufen, sind jedoch spärlich.
In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Verfügung, um Immunzellen-Teilmengen zu identifizieren, die von der Leber und dem Fettgewebe isoliert sind, in einem zuverlässigen Mausmodell von NASH, das durch die Unterbringung von fettreichen Diät-Mäusen (HFD) unter unspezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen ohne Sperre für mindestens sieben Wochen. Wir zeigen den Umgang mit Mäusen unter nicht-seften Bedingungen, die Verdauung des Gewebes und die Identifizierung von Makrophagen, natürlichen Killerzellen (NK), dendritischen Zellen, B und T-Zell-Untergruppen durch Fließzytometrie. Repräsentative Flow-Zytometrie-Parzellen von SPF-HFD-Mäuse und Nicht-SPF-Mäusen werden zur Verfügung gestellt. Um verlässliche und interpretierbare Daten zu erhalten, sind der Einsatz von Antikörpern, präzisen und präzisen Methoden zur Gewebeverdauung und der richtigen Gattung in Strömungszytometrie-Experimenten entscheidende Elemente.
Der Eingriff zur Wiederherstellung der physiologischen Antigen-Exposition bei Mäusen, indem er sie unter nicht-slawischen Bedingungen unterbringt, und die unspezifische Exposition gegenüber mikrobiellen Antigenen könnten ein relevantes Instrument zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen immunologischen Veränderungen sein, die durch die Ernährung verursacht werden. Fettleibigkeit und damit verbundene Langzeitkomplikationen.
Introduction
Fettleibigkeit ist eine multifaktorielle Erkrankung und ein wichtiger Risikofaktor für die Entwicklung von Herzerkrankungen, Schlaganfall, alkoholfreier Steatohepatitis (NASH), Typ-2-Diabetes (T2D) und einigen Krebsarten. Die Verbreitung von Fettleibigkeit nimmt weltweit rapide zu. Heute sind 2,1 Milliarden Menschen — fast 30% der Weltbevölkerung — entweder fettleibig oder übergewichtig1. Fettleibig-assoziierte Insulinresistenz kann zu T2D führen, wenn erschöpfte Bauchspeicheldrüsen-Beta-Zellen den erhöhten Bedarf an Insulin zur Aufrechterhaltung der Glukose-Homöostase2nicht kompensieren.
Das Fettgewebe besteht aus verschiedenen Zelltypen, darunter Adipozyten, Endothelzellen, Fibroblasten und Immunzellen. Während des Fortschritts der Fettleibigkeit können Veränderungen in der Anzahl und Aktivität von Immunzellen zu einer minderwertigen Entzündung des hypertrophischenFettgewebes 3,4führen. Konkret wurde festgestellt, dass eine übermäßige Energieaufnahme, begleitet von chronisch erhöhten Blutzuckerwerten, Triglyceriden und freien Fettsäuren, zu Adipozyten-Hypoxie, endoplasmatischer Retikelstress, beeinträchtigter Mitochondrien-Funktion und Verstärkten die Cytokin-Sekretion, was zur Aktivierung von entzündungshemmenden Fettzellen5,6führt. Die bisherigen Forschungen haben sich vor allem auf die angeborene Immunität konzentriert, aber in jüngerer Zeit haben sich adaptive Immunzellen (T und B-Zellen) als wichtige Regulatoren der Glukose-Homöostase herausgebildet. Sie verfügen über entzündliche Funktionen (einschließlich CD8+ T-Zellen, Th1 und B-Zellen) oder vor allem über regulatorische Funktionen (einschließlich regulatorischer T (Treg) Zellen, Th2-Zellen) und können sowohldie Insulinresistenz von7,8 verschärfen noch schützen. , 9. September
Darüber hinaus wurden mehrere Mechanismen vorgeschlagen, um zu erklären, wie Fettleibigkeit die Steatohepatitis erhöht, einschließlich der erhöhten Produktion von Zytokinen durch Fettgewebe 10. NASH, die fortschreitende Form der alkoholfreien Fettlebererkrankung und eine große gesundheitliche Belastung in den Industrieländern, ist histologisch durch aufgeblasene Hepatozyten, Fettansammlungen, Fibrose und pericelluläre Entzündungen gekennzeichnet und kann sich fortentwickeln, um Zirrhose, Lebererkrankung im Endstadium oder hepatokelluläres Karzinom. Mehrere Regimen (zum Beispiel die Methion-und Cholin-Mangelnahrung 11) sind dafür bekannt, dass sie in nicht-menschlichen Tiermodellen eine NASH-ähnliche Leberpathologie hervorrufen, aber die meisten dieser Ansätze rekapitulieren die menschlichen Bedingungen der NASH und ihrer Stoffwechsels nicht. Konsequenzen, da sie entweder einen spezifischen Genknockout, nicht-physiologische Ernährungsmanipulationen oder keine Insulinresistenz erfordern, die typisch für die menschliche NASH ist. Darüber hinaus basiert unser Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen von Stoffwechselerkrankungen derzeit auf Experimenten, die mit Labormäusen durchgeführt werden, die unter den üblichen pathogenfreien (SPF) Bedingungen untergebracht sind. Diese Barriereanlagen sind ungewöhnlich hygienisch und berücksichtigen nicht die mikrobielle Vielfalt, auf die der Mensch stoßen muss, was für Schwierigkeiten im Übersetzungsprozess von Tierstudien zu klinischen Ansätzen 12, 13 verantwortlich sein kann. , 14.
Um die verschiedenen Immunzelluntergruppen in Fettgewebe und Leber bei der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH in einem fortgeschrittenen Mausmodell zu untersuchen, das menschliche Immunbedingungen reproduziert, wurden Mäuse in einzelnen Käfigen in halbsterilen Bedingungen ohne Barriere. Mäuse, die unter Antigen-exponierten Bedingungen untergebracht waren, entwickelten bereits nach 15 Wochen fettreicher Ernährung(HFD) eine NASH-ähnliche Leberpathologie. Im Vergleich zu altersgerechten SPF-Mäusen entwickelten sie makrovesikuläre Steatose, Leberinfiltration und Aktivierung von Immunzellen.
Dieses Manuskript beschreibt eine robuste Strömungszytometrie-Analyse, um Immunzellen-Teilmengen aus dem Fettgewebe und der Leber der Maus in einem Modell von NASH zu definieren und zu zählen. Die Strömungszytometrie-Analyse ermöglicht die Ermittlung mehrerer Parameter einzelner Zellen gleichzeitig im Gegensatz zu RT-PCR oder Immunhistochemie-Ansätzen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unsere Studie ein Mausmodell der kurzfristigen HFD zur Untersuchung der Entwicklung von Insulinresistenz und NASH sowie den zugrundeliegenden Mechanismen bietet, die auch die Treue zum menschlichen Zustand aufweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Steatohepatitis hat eine starke Verbindung mit Stoffwechselstörungen wie Fettleibigkeit, Insulinresistenz und Dyslipidämie15. Mehrere Studien deuten darauf hin, dass eine Fettgewebe-Entzündung die Pathogenese von Typ-2-Diabetes antreiben kann, einschließlich veränderter Zellwerte sowohl des angeborenen als auch des adaptiven Immunsystems 4,5,16, 17 . Darüber hi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Anke Jurisch, Diana Woellner, Dr. Kathrin Witte und Cornelia Heckmann für die Unterstützung bei experimentellen Verfahren und Benjamin Tiburzy von Biolegend für hilfreiche Kommentare zur Gating-Strategie. J.S. wurde vom Helmholtz Grant (ICEMED) unterstützt. Die Studie wurde durch Stipendien der Klinischen Forschergruppe des Berliner Instituts für Gesundheit (BIH), des “BCRT-Stipendiums” des Bundesministeriums für Bildung und Forschung und der Einstein-Stiftung unterstützt. K.S.-B. Und H.-D.V. wird von FOR2165 finanziert.
Materials
| 100µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| 1ml syringe | BD | 309659 | |
| 26G x 5/8 needles | BD | 305115 | |
| 35mm Petri Dishes | Falcon | 353001 | |
| 40µm cell strainers | Falcon | 352340 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45 | Biolegend | 103127 | AB_493714 (BioLegend Cat. No. 103127) |
| Analysis software | FlowJo 10.0.8 software | ||
| APC anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117309 | AB_313778 (BioLegend Cat. No. 117309) |
| APC anti-mouse KLRG1 (MAFA) Antibody | Biolegend | 138411 | AB_10645509 (BioLegend Cat. No. 138411) |
| BV421 anti-mouse CD127 Antibody | Biolegend | 135023 | AB_10897948 (BioLegend Cat. No. 135023) |
| BV421 anti-mouse F4/80 Antibody | Biolegend | 123131 | AB_10901171 (BioLegend Cat. No. 123131) |
| BV605 anti-mouse CD279 (PD-1) Antibody | Biolegend | 135219 | AB_11125371 (BioLegend Cat. No. 135219) |
| BV605 anti-mouse NK-1.1 Antibody | Biolegend | 108739 | AB_2562273 (BioLegend Cat. No. 108739) |
| BV650 anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101239 | AB_11125575 (BioLegend Cat. No. 101239) |
| BV711 anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103255 | AB_2563491 (BioLegend Cat. No. 103255) |
| BV785 anti-mouse CD8a Antibody | Biolegend | 100749 | AB_11218801 (BioLegend Cat. No. 100749) |
| C57Bl/6J mice, male, 5 weeks old | Forschungseinrichtungen für experimentelle Medizin (FEM) | ||
| CaCl2 | Charité – Universitätsmedizin Berlin | A119.1 | |
| Collagenase NB 4G Proved Grade | SERVA | 11427513 | |
| Collagenase Typ I | Worthington | LS004197 | |
| Conical centrifuge tube 15ml | Falcon | 352096 | |
| Conical centrifuge tube 50ml | Falcon | 352070 | |
| DNAse | Sigma-Aldrich | 4716728001 | |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S0115 | |
| Filter 30µm | Celltrics | 400422316 | |
| FITC anti-mouse CD3 Antibody | Biolegend | 100203 | AB_312660 (BioLegend Cat. No. 100203) |
| Flow cytometry | BD-LSR Fortessa | ||
| Forceps | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | |
| HBSS | Bioanalytic GmBH | 085021-0500 | |
| High-fat diet | SSNIF | E15741–34 | 60 kJ% from fat, 19 kJ% from proteins, and 21 kJ% from carbohydrates |
| micro dissecting scissors | Sigma-Aldrich | S3146 | used for dissection purposes |
| PE anti-mouse CD25 Antibody | Biolegend | 101903 | AB_312846 (BioLegend Cat. No. 101903) |
| PE/Cy7 anti-mouse CD62L Antibody | Biolegend | 104417 | AB_313102 (BioLegend Cat. No. 104417) |
| PE/Cy7 anti-mouse I-A/I-E (MHCII) Antibody | Biolegend | 107629 | AB_2290801 (BioLegend Cat. No. 107629) |
| PE/Dazzle 594 anti-mouse CD4 Antibody | Biolegend | 100565 | AB_2563684 (BioLegend Cat. No. 100565) |
| Percoll solution | Biochrom | L6115 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD44 Antibody | Biolegend | 103031 | AB_2076206 (BioLegend Cat. No. 103031) |
| PerCP/Cy5.5 anti-mouse Gr-1 Antibody | Biolegend | 108427 | AB_893561 (BioLegend Cat. No. 108427) |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 12559069 | |
| Round-Bottom Tubes with cell strainer cap | STEMCELL Technologies | 38030 | |
| TruStain fcX anti-mouse CD16/32 | Biolegend | 101301 | AB_312800 (BioLegend Cat. No. 101301) |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T6146 | |
| Zombie NIR Fixable Viability Kit | Biolegend | 423105 | viablity stain |
Riferimenti
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