अवअधोहनुज और Parotid लार ग्रंथियों मॉडल में से Organotypic संस्कृतियों के विकिरण उपचार Vivo में विशेषताएं
Summary
आकारिकी और लार ग्रंथियों के कार्यात्मक मार्कर कल्पना करने के लिए तीन आयामी organotypic संस्कृतियों का उपयोग कर विकिरण के बाद ऊतक क्षति के तंत्र में उपंयास अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । यहां वर्णित खंड के लिए एक प्रोटोकॉल है, संस्कृति, irradiate, दाग, और छवि 50-90 μm मोटी लार ग्रंथि वर्गों से पहले और निंनलिखित ionizing विकिरण के लिए जोखिम ।
Abstract
हाइपोलिवेशन और ज़ेरोस्टोमिया पुरानी मौखिक जटिलताओं को पैदा करते हैं जो रेडियोथेरेपी से इलाज करने वाले सिर और गर्दन के कैंसर रोगियों में जीवन की गुणवत्ता को घटाते हैं । लार ग्रंथि में शिथिलता और बहाली के तंत्र को समझने के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोण vivo मॉडल है, जो योजनाबद्ध रूप से चिकित्सकीय उंमीदवारों और अभिकर्मक में दक्षता स्क्रीन करने के लिए असमर्थता से विकलांग है पर ध्यान केंद्रित किया है विशिष्ट जीन में हेरफेर करने की क्षमता. इस लार ग्रंथि organotypic संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य संस्कृति व्यवहार्यता के अधिकतम समय का मूल्यांकन और पूर्व vivo विकिरण उपचार के बाद सेलुलर परिवर्तन विशेषता है । हम immunoफ्लोरोसेंट धुंधला और संनाभि माइक्रोस्कोपी का उपयोग जब विशिष्ट सेल आबादी और मार्कर एक 30 दिन की संस्कृति की अवधि के दौरान मौजूद हैं निर्धारित करने के लिए । इसके अलावा, सेलुलर मार्कर पहले में vivo में विकिरण मॉडल में रिपोर्ट की संस्कृतियों में मूल्यांकन कर रहे हैं कि पूर्व vivo विकिरणित कर रहे हैं. आगे चल रहा है, इस विधि murine और मानव लार ग्रंथि ऊतक प्रतिक्रियाओं के चिकित्सकीय एजेंटों कि लार समारोह में सुधार करने के लिए रैपिड ex vivo के मूल्यांकन के लिए एक आकर्षक मंच है ।
Introduction
उचित लार ग्रंथि समारोह मौखिक स्वास्थ्य के लिए आवश्यक है और1रेडियोथेरेपी के साथ सिर और गर्दन के कैंसर के इलाज के बाद बदल दिया है । २०१७ में, संयुक्त राज्य अमेरिका2में सिर और गर्दन के कैंसर के लगभग ५०,००० नए मामलों की सूचना दी गई थी । ऊतक के कारण-इस तरह लार ग्रंथियों के रूप में आसपास के सामान्य ऊतकों पर विकिरण चिकित्सा के हानिकारक और अक्सर अपरिवर्तनीय प्रभाव, रोगियों अक्सर गंभीर साइड इफेक्ट के साथ छोड़ दिया जाता है और जीवन की गुणवत्ता कम2,3, ४। आम जटिलताओं के कारण विकिरण नुकसान प्रकट होता है जैसे लक्षण में xerostomia (शुष्क मुँह की व्यक्तिपरक भावना), दंत क्षय, चबाने और निगलने के लिए बिगड़ा क्षमता, भाषण impairments, और मौखिक microbiomes से समझौता2, 3 । , 4. इन लक्षणों को सामूहिक रूप से प्रभावित व्यक्तियों में कुपोषण और बिगड़ा जीवित रहने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं5. जबकि इस जनसंख्या में लार ग्रंथि में शिथिलता अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, कोष्ठकी कोशिकाओं को नुकसान की अंतर्निहित तंत्र विवादित किया गया है, और वहां विभिंन पशु मॉडल6,7के बीच थोड़ा एकीकरण है ।
लार ग्रंथि समारोह और विकिरण प्रेरित नुकसान का अध्ययन करने के वर्तमान तरीकों vivo मॉडल में का उपयोग शामिल, अमर सेल लाइनों, दो आयामी (2 डी) प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों, और तीन आयामी (3 डी) salisphere संस्कृतियों8, 9,10,11,12। परंपरागत रूप से, कोशिका सांस्कृतिक मॉडल से अमर सेल लाइनों और 2-डी संस्कृतियों एक स्तरित फ्लैट सतहों पर सभ्य कोशिकाओं को शामिल करने और तेजी से, आसान है, और लागत प्रभावी प्रयोग के लिए मूल्यवान हैं । हालांकि, कृत्रिम कोशिका संस्कृति की स्थिति भेदभाव की स्थिति और विभिन्न स्थितियों को उजागर कोशिकाओं की शारीरिक प्रतिक्रियाओं को बदल सकते हैं, और परिणाम अक्सर पूरे जीव मॉडल के लिए अनुवाद करने में विफल14,15. इसके अलावा, अमर सेल संस्कृतियों डीएनए क्षति के लिए लार ग्रंथि प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है, जो p53 गतिविधि के मॉडुलन की आवश्यकता होती है16,17.
3-डी salisphere संस्कृतियों के लिए समृद्ध कर रहे हैं स्टेम और प्रजनक कोशिकाओं में प्रारंभिक समय बिंदुओं पर संस्कृति में और लार ग्रंथि कोशिकाओं के इस सबसेट की रेडियोसंवेदनशीलता को समझने के लिए उपयोगी किया गया है9,18. इन सभी संस्कृति मॉडल का एक महत्वपूर्ण सीमा है कि वे लार ग्रंथि के 3-डी संरचना visualizing में अप्रभावी कर रहे हैं, extracellular मैट्रिक्स सहित (ecm) और सेल सेल बातचीत विभिंन परतों पर, जो नियमन में महत्वपूर्ण है लार स्राव15। एक तरीका है कि एक पूरे के रूप में ऊतक के व्यवहार शामिल है लेकिन यह भी प्रयोगशाला की स्थिति में हेरफेर किया जा सकता है उपचार के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और अधिक विकिरण प्रेरित लार ग्रंथि के अंतर्निहित तंत्र की खोज के लिए आवश्यक है के लिए की जरूरत रोग.
लाइव ऊतक परिच्छेदन और संस्कृति पहले19,20 प्रलेखित किया गया है और अक्सर मस्तिष्क ऊतक बातचीत21अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । पिछले अध्ययनों में, कर्णमूलीय (PAR) लार ग्रंथि ऊतक चूहों से लगभग ५० μm पर sectioned था और ४८ एच के लिए सुसंस्कृत, और व्यवहार्यता का विश्लेषण, सेल मौत, और समारोह के बाद19प्रदर्शन किया गया था । सु एट अल। (२०१६) इस पद्धति पर विस्तारित मानव अवअधोहनुज ग्रंथियों (SMGs) को ३५ μm या ५० μm पर 14 दिनों के लिए sectioned। प्रस्तावित विधि में एक उंनति है कि यह दोनों कर्णमूलीय और अवअधोहनुज लार ग्रंथियों ५० μm और ९० μm और संस्कृतियों के मूल्यांकन में 30 दिनों के लिए sectioned शामिल है । ऊतक मोटाई की एक सीमा में कटौती करने की क्षमता सेल सेल और सेल-ecm बातचीत है कि सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए प्रासंगिक है के मूल्यांकन में महत्वपूर्ण है सहित apical-basolateral polarity और स्राव के लिए इन्नेर्वतिओन । इसके अलावा, लार ग्रंथि स्लाइसें जबकि संस्कृति में विकिरण प्रेरित लार ग्रंथि क्षति का अध्ययन करने के लिए इस संस्कृति मॉडल की व्यवहार्यता निर्धारित करने के लिए किरणित थे ।
इस लार ग्रंथि organotypic संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य संस्कृति व्यवहार्यता के अधिकतम समय का मूल्यांकन और पूर्व vivo विकिरण उपचार के बाद सेलुलर परिवर्तन विशेषता है । अधिकतम समय वर्गों है कि पोस्ट-विच्छेदन व्यवहार्य है निर्धारित करने के लिए, trypan नीला धुंधला, जीवित कोशिका धुंधला, और कोशिका मृत्यु के लिए immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन किया गया । Confocal माइक्रोस्कोपी और immunoफ्लोरोसेंट धुंधला विशिष्ट सेल आबादी, रूपात्मक संरचनाओं, और प्रसार के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया गया । ऊतक अनुभाग संस्कृतियों भी ionizing विकिरण को उजागर करने के लिए इस 3-डी मॉडल में विभिंन मार्कर पर विकिरण के प्रभाव का निर्धारण किया गया । सेल डेथ, साइकास्केलेटल व्यवधान, विभेदन मार्करों की हानि, और किरणित पूर्व vivo में संस्कृतियों में प्रतिपूरक प्रसार के प्रेरण विवो मॉडल में पिछले अध्ययनों की तुलना में थे । यह पद्धति विकिरण क्षति के बाद कोशिका-कोशिका अन्योन्यक्रिया की भूमिका की जांच करने का साधन प्रदान करती है और चिकित्सीय हस्तक्षेपों की प्रभावकारिता का कुशलतापूर्वक मूल्यांकन करने के लिए एक प्रायोगिक मॉडल प्रदान करती है (जीन जोड़तोड़ या औषधीय कारक ) कि कम वीवो मॉडल के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
लार ग्रंथि अनुसंधान संस्कृति मॉडल के एक नंबर का उपयोग किया है, अमर 2 सहित-D संस्कृतियों, प्राथमिक 2-डी संस्कृतियों, 3 डी salisphere संस्कृतियों, और 3-भ्रूणीय explants से डी अंग संस्कृतियों अंतर्निहित जीव विज्ञान और शरी…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के पायलट अनुसंधान और डिस्कवरी और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के एरिजोना कार्यालय (R01 DE023534) के द्वारा क्रिस्टन Limesand के विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की वित्त पोषण द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । कैंसर जीवविज्ञान प्रशिक्षण अनुदान, T32CA009213, वेन यू वांग के लिए वजीफा सहायता प्रदान की । लेखक अपने मूल्यवान तकनीकी योगदान के लिए एम. राइस का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे ।
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
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