顎下および耳下腺唾液腺からの Organotypic 培養の放射線治療は生体内特性をモデル化する
Summary
3次元 organotypic 培養を用いて唾液腺の形態や機能マーカーを可視化することで、放射線後の組織損傷のメカニズムについて、新たな知見を得ることができます。ここで説明されているのは、電離放射線への曝露の前に、培養、照射、染色、50 ~ 90 μ m の厚い唾液腺切片を断面化するためのプロトコルである。
Abstract
Hyposalivation と口内乾燥症は、放射線治療を受けている頭頸部癌患者の生活の質を低下させる慢性口腔合併症を作り出す。唾液腺機能障害と回復のメカニズムを理解するための実験的アプローチは、生体内モデルに着目しており、治療候補のスクリーニングを体系的に行うことができず、トランスフェクションの効率が低下している特定の遺伝子を操作する能力。この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。Immunofluorescent 染色と共焦点顕微鏡検査を利用して、30日間の培養期間中に特定の細胞集団とマーカーがいつ存在するかを判断しました。さらに、生体内放射線モデルで以前に報告された細胞マーカーは、ex 生体内に照射された培養液中で評価される。前進して、この方法は、唾液機能を改善する治療薬に対するマウスおよびヒトの唾液腺組織応答の迅速な ex インビボ評価のための魅力的なプラットホームである。
Introduction
適切な唾液腺機能は、口腔の健康に不可欠であり、放射線治療1による頭頸部癌処置の後に変化する。2017年、米国では、約5万の新しい頭頸部癌症例が報告された。唾液腺のような周囲の正常組織に対する放射線療法の組織損傷およびしばしば不可逆的効果のために、患者はしばしば重篤な副作用を残し、生活の質を低下させる2、3、 4.放射線障害によって引き起こされる一般的な合併症は、口内乾燥症 (口内乾燥の主観的感覚)、齲蝕、咀嚼・嚥下能力の障害、発話障害、経口フローラ2などの症状に現れる3,4.これらの症状を総称して、罹患した個体5における栄養不良および生存障害を引き起こす可能性がある。この集団における唾液腺機能障害は十分に立証されているが、腺房細胞への損傷の根底にあるメカニズムは論争されており、異なる動物モデル6、7間の統合はほとんどない。
唾液腺機能と放射線による損傷を研究する現在の方法は、in vivo モデルの使用、不死化細胞株、二次元 (2-d) 一次細胞培養、および三次元 (3-d) salisphere の培養8、 9、10、11、12。伝統的に、不死化細胞株と二次元培養物からの細胞培養モデルは、平らな表面で培養された単層細胞を含み、迅速で、簡単で、費用対効果の高い実験に有用である。しかしながら、人工細胞培養条件は、様々な条件に曝露した細胞の分化状態および生理的応答を変化させることができ、そしてその結果は、生物モデル14,15全体に翻訳することがしばしば失敗する。さらに、不死化細胞培養には p53 活性の変調が必要であり、これは DNA 損傷16,17に対する唾液腺応答にとって重要である。
培養中の初期時点での幹細胞および前駆細胞の salisphere 培養が濃縮されており、この唾液腺細胞のこのサブセットの放射線感受性を理解するのに有用である9、18。これらすべての培養モデルの決定的な限界は、細胞外マトリックス (ECM) および細胞細胞相互作用を含む唾液腺の三次元構造を、唾液の調節に極めて重要である様々な層にわたって可視化する上では効果がないことである。分泌15.組織全体の行動を包含する方法の必要性しかし、治療の効果を研究するために実験室条件下で操作することも可能であり、放射線誘発性唾液腺の根底にあるメカニズムをさらに発見する必要がある機能 不全。
生きたティッシュの区分および文化は前に19,20文書化され、多くの場合、脳組織相互作用21を研究するために使用される。これまでの研究では、マウス由来の耳下腺唾液腺組織を約50μ m に切片化し、最大 48 h の培養を行い、その後19個の生存率、細胞死、機能の解析を行った。Su et al.(2016) 顎下腺 (SMGs) を35μ m または50μ m で切片にして20日間培養することにより、この方法論を拡充した。本手法は、50μ m および90μ m で切片となった耳下腺および顎下唾液腺の両方を含み、30日間培養の評価を行うという進歩である。組織の厚さの範囲をカットする能力は、尖 basolateral 極性および分泌の神経支配を含む細胞プロセスに関連する細胞細胞および細胞-ECM 相互作用を評価する上で重要である。さらに、この培養モデルの実現可能性を判断するために培養中に唾液腺切片を照射し、放射線による唾液腺損傷を研究した。
この唾液腺 organotypic 培養プロトコールの目的は、培養生存率の最大時間を評価し、ex vivo 放射線治療後の細胞変化を特徴付けることである。後郭清可能な最大時間切片を決定するために、トリパンブルー染色、生細胞染色、および細胞死に対する免疫組織化染色が実施された。共焦点顕微鏡と immunofluorescent 染色は、特定の細胞集団、形態学的構造、および増殖のレベルを評価するために利用された。組織セクション培養物はまた、この3-d モデルにおける様々なマーカーに対する放射線の影響を決定するために電離放射線に暴露された。細胞死の誘導、骨格破壊、分化マーカーの欠損、および照射された ex インビボ培養物における代償性増殖を、インビボモデルの以前の研究と比較した。この方法論は、放射線損傷後の細胞間相互作用の役割を調査するための手段を提供し、治療的介入の有効性を効率的に評価するための実験的モデルを提供する (遺伝子操作または薬理学的薬剤) は、in vivo モデルにはあまり適していない可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
唾液腺研究では、不死化2次元培養、主な2次元培養、3次元 salisphere 培養、および胚外植片からの三次元器官培養を含む多くの培養モデルを利用して、基礎となる生物学と生理学に関する疑問を確認しました。これらの培養モデルは、多様な研究課題にわたって洞察に富んだ情報をもたらし、唾液中の研究においても重要なツールであり続けます。これらの培養モデルの限界には、不死化中の …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作業は、アリゾナ大学の研究と発見と国立衛生研究所 (R01 DE023534) のキルスティン・ Limesand によって提供されるパイロット資金によって部分的にサポートされていました。癌生物学トレーニング助成金、T32CA009213 は、ウェン・ユウ・ウォンのための俸給支援を提供しました。著者は、彼の貴重な技術貢献のために m. ライスに感謝したいと思います。
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ – The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren’s syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
