הטיפול בקרינה של תרבויות אורגנוטימית מתוך הלסת התחתונה ובלוטות הרוק פרודה מודלים מפתח Vivo מאפיינים
Summary
שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.
Abstract
היפרליבציה ו xerostomia ליצור סיבוכים אוראלי כרונית הפחתת איכות החיים בראש ובחולי סרטן הצוואר אשר מטופלים עם הקרנות. הגישות הנסיוניות להבנת מנגנונים של תפקוד בלוטת הרוק ושיקום התמקדו במודלים vivo, אשר מוגבלים על ידי חוסר יכולת למסך בשיטתיות מועמדים טיפוליים ויעילות בניתוח יכולת לתמרן גנים ספציפיים. המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע מתי אוכלוסיית תאים וסמנים ספציפיים נמצאים בתקופת תרבות של 30 יום. בנוסף, סמנים סלולריים דיווחו בעבר ב vivo מודלים קרינה מוערכים בתרבויות כי הם לשעבר לקרינה vivo. מעבר קדימה, שיטה זו היא פלטפורמה אטרקטיבית עבור הערכה מהירה לשעבר vivo של murine והאדם בלוטת הרוק התגובות התגובה לסוכנים הטיפוליים לשפר את תפקוד הרוק.
Introduction
תפקוד תקין בלוטת הרוק חיוני לבריאות הפה והוא שונה לאחר הטיפול בראש ובצוואר הסרטן עם הקרנות1. ב 2017, כמעט 50,000 מקרים חדשים של סרטן הראש והצוואר דווחו בארצות הברית2. בשל השפעות מזיקות לעתים קרובות בלתי הפיך של טיפול בקרינה על רקמות הסביבה הרגילה כגון בלוטות הרוק, חולים הם לעתים קרובות עזבו עם תופעות לוואי חמורות ואיכות מופחתת של חיים2,3, ד. סיבוכים נפוצים נגרמת על ידי נזק הקרינה מתבטא בתסמינים כגון xerostomia (התחושה הסובייקטיבית של הפה היבש), עששת, היכולת הלקוי ללעוס ולבלוע, דיבור ליקויים, ו מיקרובימי אוראלי פרוצים2, מיכל שלוש , 4. הסימפטומים הללו באופן קולקטיבי יכול להוביל תזונה ולקויה הישרדות אנשים מושפעים5. בעוד תפקוד בלוטת הרוק באוכלוסייה זו היתה מתועדת היטב, המנגנונים הבסיסיים של נזק לתאים acinar היו שנויות במחלוקת, ויש שילוב קטן בין דגמי בעלי חיים שונים6,7.
השיטות הנוכחיות של לימוד תפקוד בלוטת הרוק ונזק המושרה הקרינה כוללים את השימוש במודלים vivo, שורות תאים מונצח, דו מימדי (2-D) מתרבויות התא הראשי, ו תלת מימדי (3-D) התרבות הערבה8, . תשע,עשר,11,12 באופן מסורתי, מודלים של תרבות התא מקווי תאים מונצח ותרבויות דו-ממדיות כרוכות בתאים בעלי שכבות יחיד המתורבת על משטחים שטוחים והם יקרי ערך עבור ניסויים מהירים, קלים וחסכוניים. עם זאת, התנאים של תרבות התא המלאכותי יכולים לשנות את סטטוס הבידול ואת התגובות הפיסיולוגיים של תאים חשופים לתנאים שונים, והתוצאות לעתים קרובות אינן מצליחות לתרגם את כל האורגניזם מודלים14,15. בנוסף, תרביות תאים מונצח דורשים אפנון של פעילות p53, אשר קריטי עבור תגובת בלוטת הרוק נזק DNA16,17.
תרביות תלת-מימד מועשר בתאי גזע ומחולל בזמן מוקדם בתרבות ושימושיים להבנת הרגישות הרדיושל קבוצת משנה זו של תאי בלוטת הרוק9,18. מגבלה קריטית של כל המודלים האלה של התרבות היא שהם לא יעילים בהמחיש את המבנה התלת-ממדי של בלוטת הרוק, כולל מטריצה החילוץ (ECM) ואינטראקציה תא תא על פני שכבות שונות, אשר חיוניים הרוק מודלטינג הפרשה15. הצורך בשיטה המקיף את ההתנהגות של הרקמה כמכלול, אבל יכול להיות גם מניפולציות תחת תנאי מעבדה כדי ללמוד את ההשפעות של הטיפול הוא הכרחי כדי לגלות עוד את המנגנונים הבסיסיים של בלוטת הרוק המושרה קרינה תפקוד.
שימוש ברקמה חיה ותרבות כבר תועד בעבר19,20 והוא משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות רקמות המוח21. במחקרים קודמים, פרוטיד (PAR) רקמת בלוטת הרוק מפני עכברים היה מנות ב כ 50 יקרומטר ו תרבותי עבור עד 48 h, ניתוח של הכדאיות, מוות תאים, ותפקוד בוצע לאחר מכן19. . סו ואח ‘ (2016) הורחב במתודולוגיה זו על ידי בלוטות הלסת האנושית של culturing (smgs) בשעה 35 יקרומטר או 50 יקרומטר עבור 14 ימים20. השיטה המוצעת היא התקדמות בכך שהוא כולל בלוטות הרוק השני והלסת התחתונה מנות ב 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר והערכה של התרבויות עבור 30 ימים. היכולת לחתוך מגוון רחב של רקמות חשוב בהערכת תאים סלולריים ואינטראקציות תאים-ECM הרלוונטיות לתהליכים סלולריים, כולל קוטביות-באסולתית ושימור הפרשה. יתר על כן, פרוסות בלוטת הרוק הוקרן לקרינה בעוד בתרבות כדי לקבוע את הכדאיות של מודל זה תרבות כדי ללמוד המושרה קרינה נזק בלוטת הרוק.
המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע את מקטעי הזמן המרביים הקיימים לאחר הניתוח, הכדורית כחול, מכתים תאים חיים וכתמים אימונוהיסטוכימיה עבור מוות תאים בוצעו. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתמים מוחיסוניות מנוצלים להערכת אוכלוסיות תאים מסוימות, מבנים מורפולוגיים ורמות התפשטות. תרביות מקטע רקמות נחשפו גם לקרינה מייננת כדי לקבוע את ההשפעות של קרינה על סמנים שונים במודל זה 3-D. אינדוקציה של מוות התא, הפרעה ציטושלד, הפסד של סמנים בידול, והתפשטות הפצה בתרבויות הvivo לשעבר הקרינה היו לעומת מחקרים קודמים של במודלים vivo. מתודולוגיה זו מספקת אמצעים לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא תא בעקבות נזקי קרינה ומספק מודל ניסיוני כדי להעריך ביעילות את היעילות של התערבויות טיפוליות (מניפולציות גנים או סוכני תרופתי ) שעשוי להיות מתאים פחות למודלים vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר בלוטת הרוק השתמשו במספר דגמי תרבות, כולל תרבויות דו-ממד מונצח, תרבויות דו-מימד ראשיות, תרבויות תלת-מימד, ותרבויות תלת-מימד מפני מתקנים עובריים כדי לברר שאלות על הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה. המודלים התרבותיים הללו הניבו מידע תובנה על פני מגוון מגוון של שאלות מחקר וימשיכו להיות כלים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מימון פיילוט שסופקו על ידי אוניברסיטת אריזונה המשרד של מחקר וגילוי והמכון הלאומי לבריאות (R01 DE023534) כדי קירסטן לימסנד. מלגת ההכשרה לביולוגיה של סרטן, T32CA009213, סיפקה תמיכה של הקצבה ון יו וונג. המחברים רוצים להודות מ ‘ רייס על התרומה הטכנית היקר שלו.
Materials
| Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
| Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
| 24-well plate | CellTreat | 229124 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
| Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
| Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
| Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
| L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
| Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
| Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
| Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
| DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
| Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
| 0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
| Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
| Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
| Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
| Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
| Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
| Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
| Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
| Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
| Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
| New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
| Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
| Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
| Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
| Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
| Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |
References
- Dirix, P., Nuyts, S., Van den Bogaert, W. Radiation-induced xerostomia in patients with head and neck cancer: a literature review. Cancer. 107 (11), 2525-2534 (2006).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).
- Hancock, P. J., Epstein, J. B., Sadler, G. R. Oral and dental management related to radiation therapy for head and neck cancer. Journal of the Canadian Dental Association. 69 (9), 585-590 (2003).
- Nguyen, N. P., et al. Quality of life following chemoradiation and postoperative radiation for locally advanced head and neck cancer. Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 69 (5), 271-276 (2007).
- Gorenc, M., Kozjek, N. R., Strojan, P. Malnutrition and cachexia in patients with head and neck cancer treated with (chemo)radiotherapy. Reports of Practical Oncology and Radiotherapy. Journal of Greatpoland Cancer Center in Poznań and Polish Society of Radiation Oncology. 20 (4), 249-258 (2015).
- Grundmann, O., Mitchell, G. C., Limesand, K. H. Sensitivity of salivary glands to radiation: from animal models to therapies. Journal of Dental Research. 88 (10), 894-903 (2009).
- Konings, A. W., Coppes, R. P., Vissink, A. On the mechanism of salivary gland radiosensitivity. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).
- Chan, Y. -. H., Huang, T. -. W., Young, T. -. H., Lou, P. -. J. Human salivary gland acinar cells spontaneously form three-dimensional structures and change the protein expression patterns. Journal of Cellular Physiology. 226 (11), 3076-3085 (2011).
- Nguyen, V. T., Dawson, P., Zhang, Q., Harris, Z., Limesand, K. H. Administration of growth factors promotes salisphere formation from irradiated parotid salivary glands. PLoS ONE. 13 (3), e0193942 (2018).
- Limesand, K. H., et al. Characterization of Rat Parotid and Submandibular Acinar Cell Apoptosis In Primary Culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal. 39 (3), 170 (2003).
- Wei, L., Xiong, H., Li, W., Li, B., Cheng, Y. Upregulation of IL-6 expression in human salivary gland cell line by IL-17 via activation of p38 MAPK, ERK, PI3K/Akt, and NF-κB pathways. Journal of Oral Pathology & Medicine. 47 (9), 847-855 (2018).
- Chuong, C., Katz, J., Pauley, K. M., Bulosan, M., Cha, S. RAGE expression and NF-κB activation attenuated by extracellular domain of RAGE in human salivary gland cell line. Journal of Cellular Physiology. 221 (2), 430-434 (2009).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7 (11), 612-620 (2002).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Avila, J. L., Grundmann, O., Burd, R., Limesand, K. H. Radiation-induced salivary gland dysfunction results from p53-dependent apoptosis. International Journal of Radiation Oncology, Biololgy, Physics. 73 (2), 523-529 (2009).
- Mitchell, G. C., et al. IGF1 activates cell cycle arrest following irradiation by reducing binding. of DeltaNp63 to the p21 promoter. Cell Death & Disease. 1, (2010).
- Lombaert, I. M. A., et al. Rescue of Salivary Gland Function after Stem Cell Transplantation in Irradiated Glands. PLoS ONE. 3 (4), (2008).
- Warner, J. D., et al. Visualizing form and function in organotypic slices of the adult mouse parotid gland. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 295 (3), G629-G640 (2008).
- Su, X., et al. Three-dimensional organotypic culture of human salivary glands: the slice culture model. Oral Diseases. 22 (7), 639-648 (2016).
- Mattei, G., Cristiani, I., Magliaro, C., Ahluwalia, A. Profile analysis of hepatic porcine and murine brain tissue slices obtained with a vibratome. PeerJ – The Journal of Life and Environmental Sciences. 3, 932 (2015).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- Limesand, K. H., et al. Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation. International Journal of Radiation Oncology, Biology, and Physics. 78 (2), 579-586 (2010).
- Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration. BMC Cancer. 10, 417 (2010).
- Chibly, A. M., et al. aPKCzeta-dependent Repression of Yap is Necessary for Functional Restoration of Irradiated Salivary Glands with IGF-1. Scientific Reports. 8 (1), 6347 (2018).
- Wong, W. Y., Pier, M., Limesand, K. H. Persistent disruption of lateral junctional complexes and actin cytoskeleton in parotid salivary glands following radiation treatment. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 315 (4), R656-R667 (2018).
- Emmerson, E., et al. SOX2 regulates acinar cell development in the salivary gland. eLife. 6, (2017).
- Nedvetsky, P. I., et al. Parasympathetic innervation regulates tubulogenesis in the developing salivary gland. Developmental Cell. 30 (4), 449-462 (2014).
- Kwon, H. R., Nelson, D. A., DeSantis, K. A., Morrissey, J. M., Larsen, M. Endothelial cell regulation of salivary gland epithelial patterning. Development. 144 (2), 211-220 (2017).
- Mellas, R. E., Leigh, N. J., Nelson, J. W., McCall, A. D., Baker, O. J. Zonula occludens-1, occludin and E-cadherin expression and organization in salivary glands with Sjogren’s syndrome. Jounral of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (1), 45-56 (2015).
- Daley, W. P., et al. Btbd7 is essential for region-specific epithelial cell dynamics and branching morphogenesis in vivo. Development. 144 (12), 2200-2211 (2017).
- Nam, K., et al. Post-Irradiated Human Submandibular Glands Display High Collagen Deposition, Disorganized Cell Junctions, and an Increased Number of Adipocytes. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (6), 343-352 (2016).
