שימוש תלת מימדי בתרבויות אורגאותוגית להמחיש מורפולוגיה וסמנים פונקציונלי של בלוטות הרוק עשוי לספק תובנות הרומן לתוך מנגנונים של נזק רקמות לאחר הקרינה. מתוארים כאן הוא פרוטוקול לסעיף, תרבות, הקרנת, כתם, תמונה 50 – 90 יקרומטר עבה בלוטת הרוק סעיפים לפני ובעקבות חשיפה לקרינה מייננת.
היפרליבציה ו xerostomia ליצור סיבוכים אוראלי כרונית הפחתת איכות החיים בראש ובחולי סרטן הצוואר אשר מטופלים עם הקרנות. הגישות הנסיוניות להבנת מנגנונים של תפקוד בלוטת הרוק ושיקום התמקדו במודלים vivo, אשר מוגבלים על ידי חוסר יכולת למסך בשיטתיות מועמדים טיפוליים ויעילות בניתוח יכולת לתמרן גנים ספציפיים. המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע מתי אוכלוסיית תאים וסמנים ספציפיים נמצאים בתקופת תרבות של 30 יום. בנוסף, סמנים סלולריים דיווחו בעבר ב vivo מודלים קרינה מוערכים בתרבויות כי הם לשעבר לקרינה vivo. מעבר קדימה, שיטה זו היא פלטפורמה אטרקטיבית עבור הערכה מהירה לשעבר vivo של murine והאדם בלוטת הרוק התגובות התגובה לסוכנים הטיפוליים לשפר את תפקוד הרוק.
תפקוד תקין בלוטת הרוק חיוני לבריאות הפה והוא שונה לאחר הטיפול בראש ובצוואר הסרטן עם הקרנות1. ב 2017, כמעט 50,000 מקרים חדשים של סרטן הראש והצוואר דווחו בארצות הברית2. בשל השפעות מזיקות לעתים קרובות בלתי הפיך של טיפול בקרינה על רקמות הסביבה הרגילה כגון בלוטות הרוק, חולים הם לעתים קרובות עזבו עם תופעות לוואי חמורות ואיכות מופחתת של חיים2,3, ד. סיבוכים נפוצים נגרמת על ידי נזק הקרינה מתבטא בתסמינים כגון xerostomia (התחושה הסובייקטיבית של הפה היבש), עששת, היכולת הלקוי ללעוס ולבלוע, דיבור ליקויים, ו מיקרובימי אוראלי פרוצים2, מיכל שלוש , 4. הסימפטומים הללו באופן קולקטיבי יכול להוביל תזונה ולקויה הישרדות אנשים מושפעים5. בעוד תפקוד בלוטת הרוק באוכלוסייה זו היתה מתועדת היטב, המנגנונים הבסיסיים של נזק לתאים acinar היו שנויות במחלוקת, ויש שילוב קטן בין דגמי בעלי חיים שונים6,7.
השיטות הנוכחיות של לימוד תפקוד בלוטת הרוק ונזק המושרה הקרינה כוללים את השימוש במודלים vivo, שורות תאים מונצח, דו מימדי (2-D) מתרבויות התא הראשי, ו תלת מימדי (3-D) התרבות הערבה8, . תשע,עשר,11,12 באופן מסורתי, מודלים של תרבות התא מקווי תאים מונצח ותרבויות דו-ממדיות כרוכות בתאים בעלי שכבות יחיד המתורבת על משטחים שטוחים והם יקרי ערך עבור ניסויים מהירים, קלים וחסכוניים. עם זאת, התנאים של תרבות התא המלאכותי יכולים לשנות את סטטוס הבידול ואת התגובות הפיסיולוגיים של תאים חשופים לתנאים שונים, והתוצאות לעתים קרובות אינן מצליחות לתרגם את כל האורגניזם מודלים14,15. בנוסף, תרביות תאים מונצח דורשים אפנון של פעילות p53, אשר קריטי עבור תגובת בלוטת הרוק נזק DNA16,17.
תרביות תלת-מימד מועשר בתאי גזע ומחולל בזמן מוקדם בתרבות ושימושיים להבנת הרגישות הרדיושל קבוצת משנה זו של תאי בלוטת הרוק9,18. מגבלה קריטית של כל המודלים האלה של התרבות היא שהם לא יעילים בהמחיש את המבנה התלת-ממדי של בלוטת הרוק, כולל מטריצה החילוץ (ECM) ואינטראקציה תא תא על פני שכבות שונות, אשר חיוניים הרוק מודלטינג הפרשה15. הצורך בשיטה המקיף את ההתנהגות של הרקמה כמכלול, אבל יכול להיות גם מניפולציות תחת תנאי מעבדה כדי ללמוד את ההשפעות של הטיפול הוא הכרחי כדי לגלות עוד את המנגנונים הבסיסיים של בלוטת הרוק המושרה קרינה תפקוד.
שימוש ברקמה חיה ותרבות כבר תועד בעבר19,20 והוא משמש לעתים קרובות לחקר אינטראקציות רקמות המוח21. במחקרים קודמים, פרוטיד (PAR) רקמת בלוטת הרוק מפני עכברים היה מנות ב כ 50 יקרומטר ו תרבותי עבור עד 48 h, ניתוח של הכדאיות, מוות תאים, ותפקוד בוצע לאחר מכן19. . סו ואח ‘ (2016) הורחב במתודולוגיה זו על ידי בלוטות הלסת האנושית של culturing (smgs) בשעה 35 יקרומטר או 50 יקרומטר עבור 14 ימים20. השיטה המוצעת היא התקדמות בכך שהוא כולל בלוטות הרוק השני והלסת התחתונה מנות ב 50 יקרומטר ו 90 יקרומטר והערכה של התרבויות עבור 30 ימים. היכולת לחתוך מגוון רחב של רקמות חשוב בהערכת תאים סלולריים ואינטראקציות תאים-ECM הרלוונטיות לתהליכים סלולריים, כולל קוטביות-באסולתית ושימור הפרשה. יתר על כן, פרוסות בלוטת הרוק הוקרן לקרינה בעוד בתרבות כדי לקבוע את הכדאיות של מודל זה תרבות כדי ללמוד המושרה קרינה נזק בלוטת הרוק.
המטרה של פרוטוקול זה בלוטת הרוק אורגאוטימית התרבות היא להעריך את הזמן המקסימלי של הכדאיות התרבותית ולאפיין שינויים סלולריים בעקבות טיפול קרינה vivo ex. כדי לקבוע את מקטעי הזמן המרביים הקיימים לאחר הניתוח, הכדורית כחול, מכתים תאים חיים וכתמים אימונוהיסטוכימיה עבור מוות תאים בוצעו. מיקרוסקופיה קונפוקלית וכתמים מוחיסוניות מנוצלים להערכת אוכלוסיות תאים מסוימות, מבנים מורפולוגיים ורמות התפשטות. תרביות מקטע רקמות נחשפו גם לקרינה מייננת כדי לקבוע את ההשפעות של קרינה על סמנים שונים במודל זה 3-D. אינדוקציה של מוות התא, הפרעה ציטושלד, הפסד של סמנים בידול, והתפשטות הפצה בתרבויות הvivo לשעבר הקרינה היו לעומת מחקרים קודמים של במודלים vivo. מתודולוגיה זו מספקת אמצעים לחקור את התפקיד של אינטראקציות תא תא בעקבות נזקי קרינה ומספק מודל ניסיוני כדי להעריך ביעילות את היעילות של התערבויות טיפוליות (מניפולציות גנים או סוכני תרופתי ) שעשוי להיות מתאים פחות למודלים vivo.
מחקר בלוטת הרוק השתמשו במספר דגמי תרבות, כולל תרבויות דו-ממד מונצח, תרבויות דו-מימד ראשיות, תרבויות תלת-מימד, ותרבויות תלת-מימד מפני מתקנים עובריים כדי לברר שאלות על הביולוגיה הבסיסית והפיזיולוגיה. המודלים התרבותיים הללו הניבו מידע תובנה על פני מגוון מגוון של שאלות מחקר וימשיכו להיות כלים…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מימון פיילוט שסופקו על ידי אוניברסיטת אריזונה המשרד של מחקר וגילוי והמכון הלאומי לבריאות (R01 DE023534) כדי קירסטן לימסנד. מלגת ההכשרה לביולוגיה של סרטן, T32CA009213, סיפקה תמיכה של הקצבה ון יו וונג. המחברים רוצים להודות מ ‘ רייס על התרומה הטכנית היקר שלו.
Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
24-well plate | CellTreat | 229124 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |