De behandeling van de straling van Organotypic culturen van submandibulaire en Parotis speekselklieren modellen sleutel in vivo kenmerken

Summary

Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.

Abstract

Hyposalivation en xerostomie maken chronische orale complicaties die de kwaliteit van leven in hoofd-en nek kankerpatiënten die worden behandeld met radiotherapie verminderen. Experimentele benaderingen van het begrijpen van mechanismen van speekselklier dysfunctie en restauratie hebben zich gericht op in vivo modellen, die gehandicapt zijn door een onvermogen om systematisch screenen therapeutische kandidaten en efficiëntie in Transfectie mogelijkheid om specifieke genen te manipuleren. Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. We gebruikten immunefluorescentie kleuring en confocale microscopie om te bepalen wanneer specifieke cel populaties en markers aanwezig zijn tijdens een 30-daagse cultuurperiode. Bovendien worden de cellulaire markers die eerder in in vivo stralings modellen worden gerapporteerd geëvalueerd in culturen die ex vivo worden bestraald. Moving Forward, deze methode is een aantrekkelijk platform voor snelle ex vivo beoordeling van muizen en menselijke speekselklier weefsel reacties op therapeutische middelen die de speeksel functie te verbeteren.

Introduction

Een goede speekselklier functie is essentieel voor de mondgezondheid en wordt gewijzigd na hoofd en nek kankerbehandeling met radiotherapie¹. In 2017, bijna 50.000 nieuwe gevallen van hoofd en hals kanker werden gerapporteerd in de Verenigde Staten². Wegens de weefsel-beschadigende en vaak onomkeerbare gevolgen van bestralingstherapie op het omringen van normale weefsels zoals speekselklieren, worden de patiënten vaak verlaten met strenge bijwerkingen en verminderde kwaliteit van het leven^{2,3, 4}. Veelvoorkomende complicaties veroorzaakt door stralingsschade manifesteert zich in symptomen zoals xerostomie (het subjectieve gevoel van een droge mond), cariës, verminderde mogelijkheid om te kauwen en slikken, spraakstoornissen, en gecompromitteerd orale microbiomen^{2, 3 , 4}. deze symptomen collectief kan leiden tot ondervoeding en verminderde overleving in de getroffen personen⁵. Terwijl speekselklier dysfunctie in deze populatie is goed gedocumenteerd, de onderliggende mechanismen van schade aan acinaire cellen zijn betwist, en er is weinig integratie tussen de verschillende diermodellen^6,7.

De huidige methoden van het bestuderen van speekselklier functie en straling geïnduceerde schade omvatten het gebruik van in vivo modellen, onsterfelijke cel lijnen, twee-dimensionale (2-D) primaire cel culturen, en drie-dimensionale (3-D) salisphere culturen^{8, 9,10,11,12}. Traditioneel, de modellen van de cel cultuur van vereeuwigde cel lijnen en 2-D culturen impliceren enige gelaagde cellen die op vlakke oppervlakten worden gekweekt en zijn waardevol voor snelle, gemakkelijke, en rendabele experimenten. Echter, kunstmatige cel cultuur voorwaarden kunnen veranderen de differentiatie status en fysiologische reacties van cellen blootgesteld aan verschillende omstandigheden, en de resultaten vaak niet te vertalen naar hele organisme modellen^14,15. Bovendien vereisen de vereeuwigde cellen culturen modulatie van p53 activiteit, die voor de speekselklier reactie op de schade van DNA^16,17kritiek is.

3-D salisphere culturen zijn verrijkt voor stam-en voorlopercellen in de vroege tijdpunten in de cultuur en zijn nuttig geweest voor het begrijpen van de stralingsgevoeligheid van deze subset van speekselklier cellen^9,18. Een kritische beperking van al deze cultuur modellen is dat ze niet effectief zijn in het visualiseren van de 3-D structuur van de speekselklier, met inbegrip van de extracellulaire matrix (ECM) en cel-cel interacties over verschillende lagen, die cruciaal zijn in modulerende speeksel afscheiding¹⁵. De noodzaak van een methode die het gedrag van het weefsel als geheel omvat, maar kan ook worden gemanipuleerd onder laboratoriumomstandigheden om de effecten van de behandeling studie is noodzakelijk om verder te ontdekken de onderliggende mechanismen van straling geïnduceerde speekselklier Dysfunctie.

Live weefsel sectie en cultuur is gedocumenteerd eerder^19,20 en wordt vaak gebruikt om hersenweefsel interacties studie²¹. In eerdere studies, parotis (PAR) speekselklier weefsel van muizen werd in deel op ongeveer 50 µm en gekweekt voor maximaal 48 h, en analyse van de levensvatbaarheid, celdood, en functie werd uitgevoerd daarna¹⁹. Su et al. (2016) uitgebreid op deze methodologie door kweken Human submandibulaire klieren (SMGs) in 35 µm of 50 µm voor 14 dagen²⁰. De voorgestelde methode is een vooruitgang in dat het zowel parotis als submandibulaire speekselklieren omvat die bij 50 µm en 90 µm en evaluatie van de culturen 30 dagen worden deelgenomen. De capaciteit om een waaier van weefsel dikte te snijden is belangrijk in het evalueren van cel-cel en cel-ECM interactie die voor cellulaire processen met inbegrip van apicaal-basolaterale polariteit en innervatie voor afscheiding relevant zijn. Voorts werden de speekselklier plakken bestraald terwijl in cultuur om de haalbaarheid van dit cultuur model te bepalen om straling-veroorzaakte speekselklier schade te bestuderen.

Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. Voor het bepalen van de maximale tijdsecties die levensvatbaar zijn post-dissectie, trypaanblauw blauwe kleuring, levende cel kleuring, en immunohistochemische kleuring voor celdood werden uitgevoerd. Confocale microscopie en immunefluorescentie kleuring werden gebruikt om specifieke cel populaties, morfologische structuren en niveaus van proliferatie te evalueren. Weefsel sectie culturen werden ook blootgesteld aan ioniserende straling om de effecten van straling op verschillende markers in dit 3-D model te bepalen. De inductie van celdood, cytoskelet verstoring, verlies van differentiatie markeringen, en compenserende proliferatie in bestraalde ex vivo culturen werden vergeleken bij vorige studies van in vivo modellen. Deze methodologie biedt een middel om de rol van cel-cel interacties na stralingsschade te onderzoeken en biedt een experimenteel model om de effectiviteit van therapeutische interventies efficiënt te evalueren (gen manipulaties of farmacologische agentia ) die mogelijk minder geschikt zijn voor in vivo modellen.

Protocol

1. voorbereiding van vibratome Spray afneembare componenten van de vibratome met inbegrip van de buffer lade, blad gehechtheid, agarose blok mal, en laboratorium film met 70% ethanol, dan UV-steriliseren voor ten minste 30 min. Plaats en beveilig een extra vel laboratorium folie over de buffer lade om te voorkomen dat ijs vallen in. Vul de Ice kamer met crushed ice, verwijder het laboratorium film uit de buffer lade, en vul de buffer lade met 100 mL ijskoude 1x fosfaat buffered saline (PBS) …

Representative Results

Primaire 2-D culturen worden geteeld in foetale boviene serum (FBS) aangevuld media, terwijl primaire 3-D salisphere cultuur worden meestal gekweekt in serum-vrije voorwaarden10,11. Daarnaast, de twee eerdere studies gebruik te maken van vibratome culturen uit speekselklieren gekweekt hun secties in 0% of 10% FBS aangevuld media19,20. Muis submandibulaire plakjes werden op…

Discussion

Het speekselklier onderzoek heeft een aantal cultuur modellen, met inbegrip van vereeuwigde 2-D culturen, primaire 2-D culturen, 3-D salisphere culturen, en 3-D orgaan culturen van embryonale Explants gebruikt om vragen over onderliggende biologie en fysiologie te bepalen. Deze cultuur modellen hebben inzichtelijke informatie over een divers scala van onderzoeksvragen en zal blijven belangrijke instrumenten in het speeksel onderzoek. De beperkingen van deze cultuur modellen omvatten modulatie van p53 activiteit tijdens i…

Materials

Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold