Met behulp van driedimensionale organotypic culturen te visualiseren morfologie en functionele markers van speekselklieren kunnen nieuwe inzichten in de mechanismen van weefselbeschadiging na straling. Hier beschreven is een protocol bij sectie, cultuur, bestralen, vlek, en beeld 50 – 90 μm dikke speekselklier secties voorafgaand aan en na blootstelling aan ioniserende straling.
Hyposalivation en xerostomie maken chronische orale complicaties die de kwaliteit van leven in hoofd-en nek kankerpatiënten die worden behandeld met radiotherapie verminderen. Experimentele benaderingen van het begrijpen van mechanismen van speekselklier dysfunctie en restauratie hebben zich gericht op in vivo modellen, die gehandicapt zijn door een onvermogen om systematisch screenen therapeutische kandidaten en efficiëntie in Transfectie mogelijkheid om specifieke genen te manipuleren. Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. We gebruikten immunefluorescentie kleuring en confocale microscopie om te bepalen wanneer specifieke cel populaties en markers aanwezig zijn tijdens een 30-daagse cultuurperiode. Bovendien worden de cellulaire markers die eerder in in vivo stralings modellen worden gerapporteerd geëvalueerd in culturen die ex vivo worden bestraald. Moving Forward, deze methode is een aantrekkelijk platform voor snelle ex vivo beoordeling van muizen en menselijke speekselklier weefsel reacties op therapeutische middelen die de speeksel functie te verbeteren.
Een goede speekselklier functie is essentieel voor de mondgezondheid en wordt gewijzigd na hoofd en nek kankerbehandeling met radiotherapie1. In 2017, bijna 50.000 nieuwe gevallen van hoofd en hals kanker werden gerapporteerd in de Verenigde Staten2. Wegens de weefsel-beschadigende en vaak onomkeerbare gevolgen van bestralingstherapie op het omringen van normale weefsels zoals speekselklieren, worden de patiënten vaak verlaten met strenge bijwerkingen en verminderde kwaliteit van het leven2,3, 4. Veelvoorkomende complicaties veroorzaakt door stralingsschade manifesteert zich in symptomen zoals xerostomie (het subjectieve gevoel van een droge mond), cariës, verminderde mogelijkheid om te kauwen en slikken, spraakstoornissen, en gecompromitteerd orale microbiomen2, 3 , 4. deze symptomen collectief kan leiden tot ondervoeding en verminderde overleving in de getroffen personen5. Terwijl speekselklier dysfunctie in deze populatie is goed gedocumenteerd, de onderliggende mechanismen van schade aan acinaire cellen zijn betwist, en er is weinig integratie tussen de verschillende diermodellen6,7.
De huidige methoden van het bestuderen van speekselklier functie en straling geïnduceerde schade omvatten het gebruik van in vivo modellen, onsterfelijke cel lijnen, twee-dimensionale (2-D) primaire cel culturen, en drie-dimensionale (3-D) salisphere culturen8, 9,10,11,12. Traditioneel, de modellen van de cel cultuur van vereeuwigde cel lijnen en 2-D culturen impliceren enige gelaagde cellen die op vlakke oppervlakten worden gekweekt en zijn waardevol voor snelle, gemakkelijke, en rendabele experimenten. Echter, kunstmatige cel cultuur voorwaarden kunnen veranderen de differentiatie status en fysiologische reacties van cellen blootgesteld aan verschillende omstandigheden, en de resultaten vaak niet te vertalen naar hele organisme modellen14,15. Bovendien vereisen de vereeuwigde cellen culturen modulatie van p53 activiteit, die voor de speekselklier reactie op de schade van DNA16,17kritiek is.
3-D salisphere culturen zijn verrijkt voor stam-en voorlopercellen in de vroege tijdpunten in de cultuur en zijn nuttig geweest voor het begrijpen van de stralingsgevoeligheid van deze subset van speekselklier cellen9,18. Een kritische beperking van al deze cultuur modellen is dat ze niet effectief zijn in het visualiseren van de 3-D structuur van de speekselklier, met inbegrip van de extracellulaire matrix (ECM) en cel-cel interacties over verschillende lagen, die cruciaal zijn in modulerende speeksel afscheiding15. De noodzaak van een methode die het gedrag van het weefsel als geheel omvat, maar kan ook worden gemanipuleerd onder laboratoriumomstandigheden om de effecten van de behandeling studie is noodzakelijk om verder te ontdekken de onderliggende mechanismen van straling geïnduceerde speekselklier Dysfunctie.
Live weefsel sectie en cultuur is gedocumenteerd eerder19,20 en wordt vaak gebruikt om hersenweefsel interacties studie21. In eerdere studies, parotis (PAR) speekselklier weefsel van muizen werd in deel op ongeveer 50 µm en gekweekt voor maximaal 48 h, en analyse van de levensvatbaarheid, celdood, en functie werd uitgevoerd daarna19. Su et al. (2016) uitgebreid op deze methodologie door kweken Human submandibulaire klieren (SMGs) in 35 µm of 50 µm voor 14 dagen20. De voorgestelde methode is een vooruitgang in dat het zowel parotis als submandibulaire speekselklieren omvat die bij 50 µm en 90 µm en evaluatie van de culturen 30 dagen worden deelgenomen. De capaciteit om een waaier van weefsel dikte te snijden is belangrijk in het evalueren van cel-cel en cel-ECM interactie die voor cellulaire processen met inbegrip van apicaal-basolaterale polariteit en innervatie voor afscheiding relevant zijn. Voorts werden de speekselklier plakken bestraald terwijl in cultuur om de haalbaarheid van dit cultuur model te bepalen om straling-veroorzaakte speekselklier schade te bestuderen.
Het doel van deze speekselklier organotypic cultuur protocol is het evalueren van de maximale tijd van cultuur levensvatbaarheid en karakteriseren cellulaire veranderingen na ex vivo stralingsbehandeling. Voor het bepalen van de maximale tijdsecties die levensvatbaar zijn post-dissectie, trypaanblauw blauwe kleuring, levende cel kleuring, en immunohistochemische kleuring voor celdood werden uitgevoerd. Confocale microscopie en immunefluorescentie kleuring werden gebruikt om specifieke cel populaties, morfologische structuren en niveaus van proliferatie te evalueren. Weefsel sectie culturen werden ook blootgesteld aan ioniserende straling om de effecten van straling op verschillende markers in dit 3-D model te bepalen. De inductie van celdood, cytoskelet verstoring, verlies van differentiatie markeringen, en compenserende proliferatie in bestraalde ex vivo culturen werden vergeleken bij vorige studies van in vivo modellen. Deze methodologie biedt een middel om de rol van cel-cel interacties na stralingsschade te onderzoeken en biedt een experimenteel model om de effectiviteit van therapeutische interventies efficiënt te evalueren (gen manipulaties of farmacologische agentia ) die mogelijk minder geschikt zijn voor in vivo modellen.
Het speekselklier onderzoek heeft een aantal cultuur modellen, met inbegrip van vereeuwigde 2-D culturen, primaire 2-D culturen, 3-D salisphere culturen, en 3-D orgaan culturen van embryonale Explants gebruikt om vragen over onderliggende biologie en fysiologie te bepalen. Deze cultuur modellen hebben inzichtelijke informatie over een divers scala van onderzoeksvragen en zal blijven belangrijke instrumenten in het speeksel onderzoek. De beperkingen van deze cultuur modellen omvatten modulatie van p53 activiteit tijdens i…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd deels ondersteund door pilot financiering verstrekt door de Universiteit van Arizona Office of Research and Discovery en de nationale instituten van de gezondheid (R01 DE023534) aan Kirsten Limesand. De Cancer biologie training Grant, T32CA009213, mits toelage ondersteuning voor Wen Yu Wong. De auteurs willen M. Rice bedanken voor zijn waardevolle technische bijdrage.
Vibratome VT1000S | Leica Biosystems | N/A | Vibratome for sectioning |
Double Edge Stainless Steel Razor Blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low-melt |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P6543 | |
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B | Lonza | 17-745H | PSA |
24-well plate | CellTreat | 229124 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco | 14190-144 | |
Loctite UltraGel Control Superglue | Loctite | N/A | Purchased at hardware store |
Natural Red Sable Round Paintbrush | Princeton Art & Brush Co | 7400R-2 | |
Gentamicin Sulfate | Fisher Scientific | ICN1676045 | |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T-8158-100mg | |
L-glutatmine | Gibco | 25030-081 | |
Trace Elements | MP Biomedicals | ICN1676549 | |
Insulin | Fisher Scientific | 12585014 | |
Epidermal Growth Factor | Corning | 354001 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | |
Retinoic acid | Fisher Scientific | R2625-50MG | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A3160602 | |
DMEM/F12 Media | Corning | 150-90-CV | |
Millicell Cell Culture Insert | Millipore Sigma | PICM01250 | 12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate |
0.4% Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo-Fisher | R37601 | Only used LIVE dye component |
Anti-Ki-67 Antibody | Cell Signaling Technology | 9129S | |
Anti-E-cadherin Antibody | Cell Signaling Technology | 3195S | |
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody | Cell Signaling Technology | 9661L | |
Anti-SMA Antibody | Sigma-Aldrich | C6198 | |
Anti-amylase Antibody | Sigma-Aldrich | A8273 | |
Anti-CD31 Antibody | Abcam | ab28364 | |
Anti-TUBB3 Antibody | Cell Signaling Technology | 5568S | |
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Thermo-Fisher | A20185 | |
Alexa Fluor 594 Phalloidin | Thermo-Fisher | A12381 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 21568-2500 | |
Paraformaldehyde Prills | Fisher Scientific | 5027632 | |
New England Nuclear Blocking Agent | Perkin Elmer | 2346249 | No longer sold |
DAPI | Cell Signaling Technology | 4083S | |
Prolong Gold Antifade Mounting Media | Invitrogen | P36934 | |
Leica SPSII Spectral Confocal | Leica Biosystems | N/A | For confocal imaging |
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope | Leica Biosystems | N/A | |
Cobalt-60 Teletherapy Instrument | Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80 | N/A | |
Amac Box, Clear | The Container Store | 60140 | Agarose block mold |