Strålebehandling av Organotypic kulturer fra submandibular og parotid spyttkjertler modeller Key in vivo kjennetegn

Summary

Ved hjelp av tredimensjonale organotypic kulturer for å visualisere morfologi og funksjonelle markører for spyttkjertler kan gi romanen innsikt i mekanismer for vevsskade etter stråling. Beskrevet her er en protokoll til del, kultur, irradiate, beis, og bilde 50-90 μm tykke spyttkjertel seksjoner før og etter eksponering for ioniserende stråling.

Abstract

Hyposalivation og xerostomia skape kroniske muntlige komplikasjoner som reduserer livskvaliteten i hode og nakke kreftpasienter som er behandlet med strålebehandling. Eksperimentelle tilnærminger til forståelse mekanismer av spyttkjertel dysfunksjon og restaurering har fokusert på in vivo-modeller, som er handikappet av en manglende evne til systematisk skjermen terapeutiske kandidater og effektivitet i transfeksjoner evne til å manipulere spesifikke gener. Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. Vi benyttet immunofluorescent farging og konfokalmikroskopi mikroskopi for å avgjøre når bestemte celle populasjoner og markører er til stede under en 30-dagers kultur periode. I tillegg blir celle markører som tidligere er rapportert i in vivo stråling-modeller evaluert i kulturer som er bestrålt ex vivo. Fremover, denne metoden er en attraktiv plattform for rask ex vivo vurdering av murine og menneskelig spyttkjertel vev reaksjoner på terapeutiske midler som forbedrer spytt funksjon.

Introduction

Riktig spyttkjertel funksjon er avgjørende for oral helse og endres etter hode og nakke kreft behandling med strålebehandling¹. I 2017 ble nesten 50 000 nye tilfeller av hode-og nakke kreft rapportert i USA². På grunn av vev-ødeleggende og ofte irreversible effekter av strålebehandling på omkringliggende normalt vev som spyttkjertler, pasienter er ofte igjen med alvorlige bivirkninger og redusert livskvalitet^{2,3, fire}til. Vanlige komplikasjoner forårsaket av stråle skade manifesterer i symptomer som xerostomia (den subjektive følelsen av tørr munn), tannråte, nedsatt evne til å tygge og svelge, tale nedsatt funksjonsevne, og kompromittert oral microbiomes^{2, 3} andre priser ^{, 4}. disse symptomene kollektivt kan føre til underernæring og nedsatt overlevelse i berørte individer⁵. Mens spyttkjertel dysfunksjon i denne populasjonen har vært godt dokumentert, har de underliggende mekanismene for skade på acinar celler vært omstridt, og det er lite integrasjon mellom ulike dyremodeller^6,7.

Den nåværende metoder for å studere spyttkjertel funksjon og stråling-indusert skade inkluderer bruk av in vivo-modeller, udødeliggjort cellelinjer, todimensjonal (2-D) primær cellekulturer, og tredimensjonale (3-D) salisphere kulturer^{8, 9,10,11,12}. Tradisjonelt vil cellekultur modeller fra udødeliggjort cellelinjer og 2D-kulturer involvere enkelt lags celler kultivert på flate overflater og er verdifulle for rask, enkel og kostnadseffektiv eksperimentering. Imidlertid kan kunstig cellekultur forhold endre differensiering status og fysiologiske reaksjoner av celler eksponert for ulike forhold, og resultatene ofte ikke å oversette til hele organismen modeller^14,15. I tillegg udødeliggjort cellekulturer krever modulering av p53 aktivitet, noe som er avgjørende for spyttkjertel respons på DNA skade^16,17.

3-D salisphere kulturer er beriket for Stem og stamceller ved tidlig tidspunkt i kultur og har vært nyttig for å forstå radiosensitivity av denne undergruppe av spyttkjertel celler^9,18. En kritisk begrensning av alle disse kultur modeller er de er ineffektive i å visualisere 3-D strukturen i spyttkjertel, inkludert ekstracellulære matrise (ECM) og celle-celle interaksjoner over ulike lag, som er avgjørende i modulerende spytt sekresjon¹⁵. Behovet for en metode som omfatter virkemåten til vevet som helhet, men kan også manipuleres under laboratorieforhold for å studere virkningene av behandlingen er nødvendig for å ytterligere oppdage de underliggende mekanismene for stråling-indusert spyttkjertel Dysfunksjon.

Levende vev snitting og kultur har blitt dokumentert tidligere^19,20 og brukes ofte til å studere hjerne-vev interaksjoner²¹. I tidligere studier, parotid (PAR) spyttkjertel vev fra mus ble delt på ca 50 μm og kultivert for opp til 48 h, og analyse av levedyktighet, celle død, og funksjonen ble utført deretter¹⁹. Su et al. (2016) utvidet på denne metodikken ved dyrking humant submandibular kjertler (SMGs) delt på 35 μm eller 50 μm for 14 dager²⁰. Den foreslåtte metoden er en fremgang i at det inkluderer både parotid og submandibular spyttkjertler delt på 50 μm og 90 μm og evaluering av kulturer i 30 dager. Evnen til å kutte en rekke vev tykkelse er viktig i å evaluere celle-celle og Cell-ECM interaksjoner som er relevante for cellulære prosesser inkludert apikale-basolateral polaritet og innervasjon for sekresjon. Videre spyttkjertel skiver var bestrålt mens i kultur for å bestemme muligheten for denne kulturen modellen for å studere stråling-indusert spyttkjertel skade.

Hensikten med denne spyttkjertel organotypic kultur protokoll er å evaluere maksimal tid for kultur levedyktighet og karakterisere cellulære endringer etter ex vivo strålebehandling. For å bestemme maksimal tid seksjoner som er levedyktig post-disseksjon, trypan blå farging, levende celle farging, og immunhistokjemiske farging for celle død ble utført. Konfokalmikroskopi mikroskopi og immunofluorescent farging ble benyttet for å evaluere spesifikke celle populasjoner, morfologiske strukturer, og nivåer av spredning. Vevs-delen kulturer ble også utsatt for ioniserende stråling å bestemme virkningene av stråling på ulike markører i denne 3-D modellen. Induksjon av celle død, cytoskjelettkomponenter avbrudd, tap av differensiering markører, og kompenserende spredning i bestrålt ex vivo kulturer ble sammenlignet med tidligere studier av in vivo-modeller. Denne metoden gir et middel til å undersøke hvilken rolle celle-celle interaksjoner etter stråling skader og gir en eksperimentell modell for å effektivt evaluere effekten av terapeutiske intervensjoner (Gen manipulasjoner eller farmakologiske midler ) som kan være mindre egnet for in vivo-modeller.

Protocol

1. utarbeidelse av vibratome Spray avtakbare komponenter av vibratome inkludert bufferbrettet, blad vedlegg, agarose blokk mold, og laboratorie film med 70% etanol, deretter UV-sterilisere i minst 30 min. Plasser og fest et ekstra ark med laboratorie film over bufferbrettet for å hindre at isen faller inn. Fyll isen kammer med knust is, fjerne laboratoriet filmen fra bufferbrettet, og fyll bufferbrettet med 100 mL iskald 1x fosfat bufret saltvann (PBS) løsning supplert med 1% penicillin-St…

Representative Results

Primær 2-D kulturer dyrkes i fosterets storfe serum (FBS) supplert Media mens primær 3-D salisphere kultur er vanligvis kultivert i serum-frie betingelser10,11. I tillegg har de to tidligere studier utnytte vibratome kulturer fra spyttkjertler kultivert sine seksjoner i 0% eller 10% FBS supplert Media19,20. Mus submandibular skiver ble delt med en tykkelse på 50 μm ved…

Discussion

Spyttkjertel forskning har benyttet en rekke kultur modeller, inkludert udødeliggjort 2-D kulturer, primære 2-D kulturer, 3-D salisphere kulturer, og 3-D orgel kulturer fra embryonale explants å konstatere spørsmål om underliggende biologi og fysiologi. Disse kultur modeller har gitt innsiktsfull informasjon på tvers av et variert utvalg av forskning spørsmål og vil fortsette å være viktige verktøy i spytt forskning. Begrensningene i disse kultur modellene inkluderer modulering av p53 aktivitet under immortali…

Materials

Vibratome VT1000S	Leica Biosystems	N/A	Vibratome for sectioning
Double Edge Stainless Steel Razor Blades	Electron Microscopy Sciences	72000
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low-melt
Parafilm	Sigma-Aldrich	P6543
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B	Lonza	17-745H	PSA
24-well plate	CellTreat	229124
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190-144
Loctite UltraGel Control Superglue	Loctite	N/A	Purchased at hardware store
Natural Red Sable Round Paintbrush	Princeton Art & Brush Co	7400R-2
Gentamicin Sulfate	Fisher Scientific	ICN1676045
Transferrin	Sigma-Aldrich	T-8158-100mg
L-glutatmine	Gibco	25030-081
Trace Elements	MP Biomedicals	ICN1676549
Insulin	Fisher Scientific	12585014
Epidermal Growth Factor	Corning	354001
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888
Retinoic acid	Fisher Scientific	R2625-50MG
Fetal Bovine Serum	Gibco	A3160602
DMEM/F12 Media	Corning	150-90-CV
Millicell Cell Culture Insert	Millipore Sigma	PICM01250	12 mm, 0.4 um pore size for 24 well plate
0.4% Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)	Thermo-Fisher	R37601	Only used LIVE dye component
Anti-Ki-67 Antibody	Cell Signaling Technology	9129S
Anti-E-cadherin Antibody	Cell Signaling Technology	3195S
Anti-Cleaved Caspase-3 Antibody	Cell Signaling Technology	9661L
Anti-SMA Antibody	Sigma-Aldrich	C6198
Anti-amylase Antibody	Sigma-Aldrich	A8273
Anti-CD31 Antibody	Abcam	ab28364
Anti-TUBB3 Antibody	Cell Signaling Technology	5568S
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Thermo-Fisher	A20185
Alexa Fluor 594 Phalloidin	Thermo-Fisher	A12381
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600
Triton X-100	Sigma-Aldrich	21568-2500
Paraformaldehyde Prills	Fisher Scientific	5027632
New England Nuclear Blocking Agent	Perkin Elmer	2346249	No longer sold
DAPI	Cell Signaling Technology	4083S
Prolong Gold Antifade Mounting Media	Invitrogen	P36934
Leica SPSII Spectral Confocal	Leica Biosystems	N/A	For confocal imaging
Leica DMIL Inverted Phase Contrast Microscope	Leica Biosystems	N/A
Cobalt-60 Teletherapy Instrument	Atomic Energy of Canada Ltd Theratron-80	N/A
Amac Box, Clear	The Container Store	60140	Agarose block mold