Summary
Een nieuwe methode voor de bereiding van de monsters werd ontwikkeld zodat de cel- en weefseltransplantaties coculture op te sporen klein molecuul uitwisseling met behulp van spectrometrie van de massa van de beeldvorming.
Abstract
Imaging massaspectrometrie (IMS) is routinematig toegepast op drie soorten monsters: weefselsecties, spheroïden en microbiële kolonies. Deze types van monster hebben zijn geanalyseerd met behulp van laser matrix-bijgewoonde desorptie/ionisatie time-of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF MS) te visualiseren van de verdeling van eiwitten, lipiden en metabolieten in de biologische steekproef van belang. We hebben een nieuwe steekproef voorbereiding methode die de sterke punten van de drie vorige toepassingen aan te pakken een underexplored benadering combineert voor de identificatie van chemische communicatie bij kanker, door het zaaien van zoogdiercellen culturen in agarose in ontwikkeld coculture met gezonde weefsels gevolgd door uitdroging van het monster. Zoogdieren weefsels en cellen zijn cocultured in de nabijheid waardoor chemische communicatie via verspreiding tussen de weefsels en cellen. Op specifieke tijdstippen, wordt het monster agarose gebaseerde gedroogd op dezelfde wijze als microbiële kolonies IMS analyse voorbereid. Onze methode is ontwikkeld om de communicatie tussen hoogwaardige sereuze eierstokkanker afgeleid van de eileider, zoals deze met het ovarium tijdens metastase samenwerkt model. Optimalisatie van de bereiding van de monsters resulteerde in de identificatie van noradrenaline als een belangrijke chemische component in de eierstokken communicatie. Deze nieuw ontwikkelde methode kan worden toegepast op andere biologische systemen die een goed begrip van chemische communicatie tussen aangrenzende cellen of weefsels vereisen.
Introduction
Imaging massaspectrometrie (IMS) is geoptimaliseerd voor het karakteriseren van de ruimtelijke spreiding van moleculaire kenmerken in drie veelgebruikte toepassingen: weefsel segmenten, spheroïden en microbiële kolonies1,2,3. Weefsel segmenten kunnen worden gebruikt om te evalueren van de lokalisatie van metabolieten in de context van biologische omstandigheden in een host, ofwel gerichte of een ongerichte binnen een specifieke waaier van de massa. Verschillen tussen moleculaire functies zijn echter de meest belangrijke en duidelijk wanneer een gezond weefsel wordt vergeleken met een zieke aandoening, bijvoorbeeld een tumor. Deze IMS-benadering is vooral aangepast aan opsporing van ziekte biomarkers, echter het verwerven van weefselmonsters in discrete stadia in de progressie van de ziekte (zoals tumor rangen) zich verzet tegen de identificatie van signalen die belangrijk voor de inleiding van zijn kunnen de ziekte. De uitwisseling van informatie door de ruimte is een alomtegenwoordige functie van veel biologische systemen, en weefsel segmenten kunnen niet vangen dit dynamische chemische estafette. Een techniek die kan visualiseren van chemische uitwisseling en verspreiding is IMS van microbiële kolonies geteeld op agar platen; kleine moleculen kunnen te verspreiden door en over de agar en via laser matrix-bijgewoonde (MALDI-TOF) desorptie/ionisatie massaspectrometrie4kunnen worden vastgelegd. Deze groei setup kan worden gebruikt voor het identificeren van moleculen uitgewisseld tussen discrete biologische entiteiten (kolonies) en gerichtheid van de metaboliet productie ook kunt bepalen. Het platform oorspronkelijk ontworpen voor microbiële kolonie groei werd aangepast aan het verkennen van het primaire metabolisme van weefsel explantaten gegroeid met zoogdiercellen en IMS werd gebruikt voor het evalueren van de dynamische chemische uitwisseling in een in vitro zoogdieren systeem.
In de afgelopen jaren, duidelijk geworden dat hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC) vaak in de eileider epitheel (VTE ontspringt) en klik vervolgens metastasizes naar het vruchtbeginsel tijdens de vroege ziekte ontwikkeling5,6, 7 , 8. de reden dat tumorigene FTE verspreiding naar de eierstok cellen, waar grote tumoren uiteindelijk vormen en verder metastaseren, is nog onduidelijk. Eerder onderzoek heeft zich gericht op de rol van ovariële eiwitten in primaire metastase aan de eierstokken; echter, onlangs is gebleken dat de overgang van een gezonde naar een tumorigene weefsel in massale verstoring van cellulaire metabolisme resulteert en verandert van de productie van kleine molecules9,10,11. Dus veronderstelde we dat kleine moleculen die worden uitgewisseld tussen de FTE en de eierstok medeverantwoordelijk voor primaire metastase van HGSOC kunnen worden.
Met onze nieuw ontwikkelde IMS-procedure, hebben wij vastgesteld dat coculture van tumorigene FTE en gezonde eierstokweefsel de productie van noradrenaline uit de eierstok induceert. Andere celtypes of normale FTE cellen deed dit effect echter niet uitlokken. Een buitengewone voordeel van deze methode is dat de moleculaire productie en een uitwisseling van signalen waarmee echte moleculen kunnen worden gevisualiseerd, dus zelfs in een coculture is het mogelijk om de bron van een signaal te bepalen. Dit is een voordeel ten opzichte van de analyse van monsters van gehomogeniseerde, waar alle ruimtelijke informatie verloren gaat. In ons modelsysteem konden we duidelijk de productie van noradrenaline toewijzen in de eierstok. Noradrenaline is gekoppeld aan de metastase en chemoresistance van ovariële kanker, en onze opsporing van dit molecuul heeft gevalideerd, dat de nieuwe IMS-methode biologisch relevante moleculen12,13, ontdekken kan 14. deze validatie laat ons voorstellen dat deze nieuwe toepassing van IMS bijzonder nuttig zijn kan om onderzoeksgroepen die probeert om te identificeren van kleine molecules in coculture omgevingen en om te begrijpen van de vroege gebeurtenissen die van invloed zijn Celtransformatie en metastase. Het algemene doel van deze methode is het ophelderen van de identiteit en de ruimtelijke spreiding van de kleine moleculen tijdens uitwisseling tussen weefsels en organen, vertegenwoordigd door in vitro 3D celculturen of ex vivo weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden overeenkomstig de nationale instituten van gezondheid richtsnoeren voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en goedgekeurd door het Comité van het institutionele dier gebruik en zorg (IACUC) aan de Universiteit van Illinois te Chicago.
1. bereiding van reagentia
- Handhaven lymfkliertest oviductal epitheel (MOE) cellen bij 37° C met 5% CO2 in een bevochtigde incubator in alpha Minimum essentiële Medium (αMEM) media aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 10 mg/mL insuline, transferrine, selenium (ITS) , 1.8 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), 100 U/mL penicilline-streptomycine, 1 mg/mL gentamycine en estradiol-17β 18.2 ng/mL. Passeren van de cellen om 3-4 dagen, ervoor te zorgen zijn er genoeg cellen op dezelfde dag de muizen zullen worden opgeofferd.
- Bereid 2% agarose door het mengen van 1 g van lage-smelten agarose met 50 mL gedestilleerd water. Autoclaaf de agarose, laat afkoelen en vervolgens aliquot (1 mL) in 2 mL tubes (Zie Tabel van materialen) voordat agarose stolt. Agarose kan voor onbepaalde tijd bij-20 ° C worden bewaard.
- Bereiden van ten minste 2 mL 1 x Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM) media.
- Voor de matrix voor MALDI-TOF MS, bereiden 5 mg/mL 10 mL 1:1 alpha-cyano-4-hyroxycinnamic zuur (CHCA): dihydroxybenzoic zuur (DHB) (Zie Tabel van materialen) in 90:10 ACN:H2O + 0,1% trifluorazijnzuur (TFA). Bewerk ultrasone trillingen ten oplossing tot matrix is opgelost.
2. muis kolonie en eierstok verwijdering
- Fok paren van CD-1 muizen met behulp van standaard behuizing procedures te handhaven. In de buurt van de dag van de bevalling, check de muizen elke dag zodat de ouderdom van de pups is bekend.
- Euthanaseren pups op de leeftijd van 16 tot 18 dagen na inademing CO2 per NIH richtsnoeren. Leveren van CO2 (100%) in een flow tarief van 10%-20% volume per minuut kamer en blijven gedurende twee minuten na ademhaling was gestopt. Bevestig euthanasie door cervicale dislocatie.
- Desinfecteer alle chirurgische apparatuur door dompelen in 70% ethanol. Warm Leibovitz van L-15 media met 1 x penicilline-streptomycine tot 37 ° C.
- De abdominale oppervlak met 70% ethanol te desinfecteren van het gebied en Minimaliseer verontreiniging met haar natte. Greep de huid die betrekking hebben op de buikwand met behulp van botte chirurgische schaar Tang en gebruik te maken een grote V-vorm gesneden door de huid en de buikwand, bloot de interne organen.
- De inwendige organen verplaatsen naar de kant met behulp van de verlostang. Individueel grijpen elke baarmoeder hoorn met een fijne Tang en een lift iets.
- Zoek de eierstok, die aan het einde van de baarmoeder-hoorn, direct onder de nier zullen. Heelkundige schaar te ontleden de eierstok gratis bindweefsel gebruiken Snij vervolgens de ovariële hoorn doormidden.
- Verplaatsen van het ovarium oviduct en ongeveer één helft van elke baarmoeder claxon voorverwarmde Leibovitz van L-15 media.
- Verplaats onder een ontleden Microscoop zorgvuldig elke eierstok uit de omliggende bursa, het bevrijden van het oviduct, bursa en eventuele adipeus weefsel. Elke eierstok verplaatsen naar een nieuwe schotel van Leibovitz van L-15 media.
- Elke eierstok axiaal in tweeën gesneden. Houd de ovariële stukken (nu genoemd explantaten) bewaard bij 37 ° C tot beplating van agarose.
3. het opzetten van en het broeden van de ITO-behandelde dia voor Cocultures
-
Onverdeelde cocultures
- Uitvloeien, de agarose bij 70 ° C op een hete plaat.
- Plaats de scheidingslijn van de 8-well bovenop de indium tinoxide (ITO)-behandelde dia (figuur 1A). De rubberen onderkant op de scheidingslijn helpt bij hechting op de dia, maar zorg ervoor dat continu zachte neerwaartse druk uitoefenen tijdens agarose beplating om ervoor te zorgen geen lekken of mengen tussen putten.
- Verzamelen van cellen in een conische tube van 15 mL, centrifuge (5 min op 800 rpm) en resuspendeer tot 50k cellen per 150 µL in 1 x DMEM media. Als de dichtheid van een andere cel optimaal is, zorg ervoor dat bij deze stap de celsuspensie 2 x de laatste dichtheid gewenst is (bijvoorbeeld voor een eindconcentratie van 50.000 cellen in 300 µL, celdichtheid bij deze stap is 50.000 cellen in 150 µL).
- Voeg voordat plating celcultuur, ovariële explant te midden van goed (figuur 1B).
- Agarose toevoegen aan elke celcultuur in individuele 2 mL buizen net voordat plating. Voor elk putje, combineren 200 µL celsuspensie en 200 µL van vloeibaar agarose in een tube van 2 mL. Bijvoorbeeld, voor vier putten, combineren 800 µL celsuspensie en 800 µL van 2% agarose. Sommige mengsel blijft, maar iets meer dan noodzakelijk maken voorkomt luchtbellen tijdens pipetteren.
- Voeg agarose aan individuele celculturen onmiddellijk voordat plating dat cultuur van de cel. De agarose zal afkoelen in minder dan een minuut, dus wees bereid te snel plaat.
- Voeg onmiddellijk 300 µL van het mengsel van cel/agarose toe aan elk putje (Figuur 1 c). Figuur 1 c toont drie cel voorwaarden en een media voorwaarde, dat elk verguld met en zonder een eierstok.
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator dia.
-
Verdeelde Cocultures.
- Verlagen dividers van dunne, soepele plastic (figuur 2A).
Opmerking: Dit experiment wordt gebruikgemaakt van de zijden van een steriele wegwerp media bekken omdat ze plat en dun zijn. Snij ze net breed genoeg om te passen zonder speling in de schuine zijde van de put (~ 13 mm). - Uitvloeien, de agarose bij 70 ° C op een hete plaat.
- Plaats de scheidingslijn van de 8-well op de top van de ITO-behandelde dia (figuur 2B). De rubberen onderkant op de scheidingslijn helpt bij hechting op de dia, maar zorg ervoor dat continu zachte neerwaartse druk uitoefenen tijdens agarose beplating om ervoor te zorgen geen lekken of mengen tussen putten.
- Verzamelen van cellen in een conische tube van 15 mL, centrifuge (5 min op 800 rpm) en resuspendeer tot 50k cellen per 150 µL in 1 x DMEM media. Als de dichtheid van een andere cel optimaal is, ervoor te zorgen dat bij deze stap de celsuspensie 2 x de laatste dichtheid gewenst is (bijvoorbeeld voor een eindconcentratie van 50.000 cellen in 300 µL, celdichtheid bij deze stap is 50.000 cellen in 150 µL).
- Kunststof verdelers diagonaal in putten (figuur 2C) invoegen.
- Agarose aan elke celsuspensie één op een moment net voordat plating toevoegen. Voor elk putje, combineren 100 µL celsuspensie en 100 µL van vloeibaar agarose in een tube van 2 mL. Bijvoorbeeld, voor vier putten, combineren 400 µL van celkweek en 400 µL van 2% agarose. Enkele cel/agarose mengsel overblijft zal worden maar dat iets meer dan noodzakelijk voorkomt luchtbellen tijdens pipetteren.
- Voeg agarose aan individuele celculturen onmiddellijk voordat plating dat cultuur van de cel. De agarose zal afkoelen in minder dan een minuut, dus wees bereid te snel plaat.
- Aan de ene kant van de scheidingslijn, plaat 150 µL van cel/agarose mengsel. Toestaan agarose afkoelen en stollen (ongeveer één min) en verwijder de scheidingslijn (figuur 2D).
- Eierstok explant plaatsen in het midden van de lege helft van de put. Plaats 150 µL media/agarose mengsel over de bovenkant van de eierstok, en alleen met de juiste kant van de put (figuur 2E).
- Incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 in een bevochtigde incubator dia.
- Verlagen dividers van dunne, soepele plastic (figuur 2A).
4. het drogen van dia en voorbereiding van de MALDI-TOF MS
- Na vier dagen (of een voorkeurstijd punt), de kamer scheidingslijn verwijderen uit de agarose stekkers en de dia (Figuur 1 d). Voorzichtig losmaken van de zijkanten van het agarose de zaal uit met een platte spatel en trek voorzichtig de kamer naar boven, dat evenwel niet tot het verplaatsen van een agarose stekkers. Als ze bewegen zich, verplaatsen ze zachtjes zodat ze elkaar niet raken.
- Plaats de dia in een oven van 37 ° C gedurende ongeveer 4 uur, roteren 90° elke h.
Opmerking: De rotatie van de dia is belangrijk om ervoor te zorgen zelfs warmteverdeling in het monster. - Eenmaal droog, verwijder de dia uit de oven (figuur 1E).
- Toepassing van matrix oplossing met behulp van de spuitmachine (figuur 1F), met de volgende parameters: temperatuur = 30 ° C, debiet = 0,2 mL/min, aantal stadia = 8, richting = CC en mondstuk afstand = 40 mm.
Opmerking: In plaats van een sproeier van matrix, een artistieke airbrush kan worden gebruikt om toe te passen van vloeibare matrix. Dezelfde matrix oplossing kan worden gebruikt om te spuiten, maar ongeveer tweemaal zoveel oplossing is vereist. Spuiten met de dia geklemd zodat deze verticaal hangt, de dia van een 90° hoek van ongeveer één voet weg (aangepast van Hoffmann15) tot de matrix laag is zichtbaar. - Voeg 1 µL van kalibrant (fosfor rood voor doelen < 500 Da, een peptide-mengsel (Zie Tabel of Materials) voor doelstellingen < 5.000 Da) aan heldere vlek op dia. Fosfor Red vereist geen mengen met matrix, maar het mengsel peptide vereist 1:1-mengsel met matrix op de steun van ionisatie. Wachten op kalibrant om te drogen.
- Tekenen van een X in elke hoek van de dia met behulp van een permanent marker en een optische beeld met behulp van een camera of een scanner op 1.200 dpi nemen.
5. beeldvorming massaspectrometrie Data-acquisitie
- Openen van een nieuwe reeks op de analysesoftware van de IMS-gegevens (Zie Tabel van materialen). Stel de breedte van het raster op gewenste ruimtelijke resolutie, ten minste 50 µm.
- Upload het optische beeld van de dia naar de analysesoftware en set drie leren punten met behulp van de snijpunten in de X'en getekend in elke hoek.
- Aanwijzen van de regio's van belang voor beeldvorming in de acquisitie software en dienovereenkomstig een naam geven.
- Kalibreren van het instrument met behulp van de data-acquisitie software (Zie Tabel van materialen) binnen 5 ppm fout.
- Sla de geoptimaliseerde methode en run beginnen. Dit experiment geoptimaliseerd de volgende parameters: polariteit = positief, Detector = Reflectron, Laser grootte = 2, Laser macht = 50%, Reflector modus detector winst = 3 x.
6. verwerking van de IMS-gegevens
- Import .mis bestand in statistische software (Zie Tabel of Materials) voor analyse van betekenis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een optimaal gedroogde ITO dia zal resulteren in een platte gedroogde monster met minimale tot geen rimpels over het oppervlak van het agarose en agarose stukken die handhaven van ruimtelijke scheiding op de dia (Figuur 3). Figuur 3A geeft optimale drogen, terwijl figuur 3B toont de rimpels die moeten worden vermeden. Deze optimalisatie vereist zorgvuldige controle van de dia in de oven, aangezien de exacte tijden kunnen variëren op basis van de relatieve vochtigheid. Terwijl rimpels iets invloed kunnen zijn op de hoogte, en dus de massa nauwkeurigheid van de IMS signalen, invloed geen lichte rimpels op de kwaliteit van de gegevens. Elke agarose die uiteindelijk lichte rimpels heeft kan daarom nog steeds worden geanalyseerd via MALDI-TOF MS. De dia moet volledig worden gedroogd of dit kan leiden tot een explosie van het monster in het milieu hoog vacuüm van de MALDI-TOF massa spectrometer.
Andere substraten afgezien van agarose kunnen werken, maar vaak niet onderhouden hun structurele integriteit bij drogen of verwijdering van de goed kamer, wat resulteert in verspreiden over de ITO dia en verlies van ruimtelijke informatie. Bijvoorbeeld, we hebben eerder getest collageen als substraat en dit resulteerde in het verspreiden en verlies van ruimtelijke informatie toen de goed kamer was verwijderd (gegevens niet worden weergegeven). Het weefsel wordt gebruikt moet in het midden van de put als het onverdeelde, of in het midden van de halve driehoek als het is verdeeld, zodat verwerving van IMS-gegevens niet wordt verontreinigd met randeffecten. Figuur 4 ziet u voorbeelden van optimaal gelegen weefsel (a-panel) en slecht geplaatste weefsel (deelvenster B). In figuur 4B, het weefsel is gelegen aan de rand van het agarose die als beeld, kan leiden tot valse massa signalen uit de randeffecten en staat geen gebruikers om het imago van het agarose rondom het weefsel, wat betekent dat dat signalen uitgescheiden kan worden gemist tijdens de analyse. Weefsel moet zo dicht mogelijk bij het midden mogelijk, zoals aangetoond in figuur 4A.
Een reeks experimenten bepaald dat een 8-well kamer het beste schip voor incubatie, in vergelijking met een 6-well-plate en een 24-well plaat was, want de kamer 8-well in minimale verstoringen op de cellen, resulteert terwijl de andere grotere kamers vereisen agarose platen worden overgebracht naar een dia van het ITO of roestvrij staal na incubatie16. De 8-well kamers van verschillende merken van kamer dia's kunnen worden gebruikt, maar die met een zelfklevende rubberen onderkant en parallelle kanten van de putten vergemakkelijken eenvoudig invoering en verwijdering van een kunststof scheidingslijn voor de verdeelde putten. De 6-well plaat vereist veel meer materiaal en problemen met drogen van dergelijke grote gebieden. De 24-well kamer had ook problemen tijdens het drogen, omdat het effect van de meniscus duidelijk in de putjes was en daarom de stekkers gedroogd met aanzienlijk hogere randen. De 8-well zaal resulteert niet in het effect van de meniscus wanneer de agarose is verguld rechtstreeks in het midden van de put en agarose stekkers niet hoeft te worden overgebracht. Bovendien voorziet de kamer 8-well 8 voorwaarden worden getest of gecontroleerd voor in een enkele experiment. Afhankelijk van het experiment, kan het zijn belangrijke besturingselementen zoals (1) de putjes met geen eierstokken explantaten of cellen, (2) de putjes met alleen cellen of (3) de putjes met ovariële explantaten alleen. Omdat de bereiding van de monsters (precieze media en agarose concentratie, matrix bedrag, enz.) enigszins tussen runs verschilt, moeten voorwaarden worden vergeleken als ze worden verworven op dezelfde dia..
Verdere experimenten bepaald dat een dia ITO beklede het beste platform voor incubatie in vergelijking met een stalen plaat van de MALDI was omdat de dia voor visuele controle van de cel staat en positionering zorgt. Bijvoorbeeld met behulp van de ITO-dia, we kunt controleren of dat de cellen normale morfologie hebben en dat ze homogene verdeling in de agarose voorafgaand aan en de volgende uitdroging16handhaven. De dia zal ook zorgen voor opneming van fluorescerende cellijnen als nodig. Daarnaast, is verwijdering van de kamer vóór uitdroging vereist om het geheel van de agarose stekker. Als de dia is verdroogde met de zaal 8-goed nageleefd, het plastic trekt de stekker agarose uit elkaar en resulteert in grote scheuren in de pluggen. Figuur 5 toont de problemen wanneer de kamer wordt niet verwijderd vóór het drogen.
Bij het analyseren van cel populaties, is het belangrijk dat de ruimtelijke resolutie ten minste 50 µm om te beginnen met het vastleggen van de geringe omvang van de weefsel- en cellulaire interacties. Met gespoten matrix, is het mogelijk om 5 µm oplossing te bereiken, maar dit verlengt de totale tijd voor het verzamelen van de gegevens van de Spectrometrie van de massa terwijl vergelijkbare resultaten oplevert. Ruimtelijke resolutie is ook afhankelijk van de mogelijkheid om zich te concentreren op de laser in de MALDI-TOF massa spectrometer.
Over het geheel genomen hebben we deze opstelling van de dia op te sporen beste uitgewisselde kleine molecules in coculture geoptimaliseerd. Daarom proberen we tijdens gegevensanalyse moleculaire functies die alleen aanwezig zijn of aanzienlijk meer overvloedig in een agarose stekkertje van de biologische toestand van belang vertegenwoordigt. Want er de optie is voor het opnemen van zeven andere besturingselementen en voorwaarden op de dia, kan dit worden bereikt visueel en op statistische software ontworpen voor IMS-gegevens. Onze dereplication-proces na de detectie van ruimtelijk relevante massa's is uitgebreid, zodat we een hoge-resolutie massa en versnippering gegevens orthogonaal verkrijgen. De eerste stap die wij voor de dereplication is een zoektocht van de nominale massa door een database, zoals de menselijke Metabolome Database (HMDB) voor zoogdieren metabolieten. De meeste van de moleculen in de database hebben een aanzienlijk aantal spectra die betrekking hebben op veel technieken voor vergelijking met experimentele gegevens. Zodra de nominale massa hebben potentiële kandidaat-moleculen als hun vermeende identiteit, is het vaak mogelijk om fysische gegevens zoals MS/MS fragmentatie, UV profiel en retentietijd tussen de kandidaat-structuur en een standaard te vergelijken.
Bijvoorbeeld, heeft de identificatie van noradrenaline in de coculture van tumorigene cellen van de FTE geïncubeerd met eierstokweefsel gevalideerd dat deze IMS-methode voor het opsporen van relevante kleine moleculen van dit systeem16van is. Figuur 6 toont de gevoeligheid van de IMS-loopt, toont het type gegevens die men verwachten kan door het volgen van het protocol van onverdeelde chambers. Figure 7 toont ook representatieve gegevens voor de installatie van de verdeelde kamer.
Figuur 1: Workflow voor de bereiding van de monsters van onverdeelde coculture. (A) aanvaarden 8-well kamer naar geleidende kant van de ITO-gecoate slide. (B) plaats gehalveerd eierstokken in centrum van putten voor coculture voorwaarden. (C) 300 toevoegen µL van agarose/celsuspensie rechtstreeks in putten. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen en dat het vruchtbeginsel in het midden van de put blijft. Als de afgepipetteerde agarose verstoord de eierstok, zachtjes kunt het uiteinde van de pipet het centreren voordat de agarose koelt. (D) na vier dagen incubatie (of anders geoptimaliseerd tijd) 8-well kamer uit dia verwijderen. Als agarose verbonden aan kamer blijft, zachtjes loskoppelen agarose stekker uit kamer met behulp van een spatel en het op de dia te verplaatsen. De agarose voldoet niet aan de dia, dus het zal gemakkelijk te verplaatsen. Een 'X' in elke hoek van de dia tekenen en neem een foto. (E) droog de dia in een oven van 37 ° C gedurende 4 uur, roterende 90 ° elk uur. Agarose moet volledig worden gedroogd en plat op de dia moet liggen. (F) Apply matrix van keuze via een sproeier of airbrush te glijden. Matrix laag zichtbaar moet zijn als geel. Scannen van de dia op een scanner op 1200 dpi en voeg kalibranten of normen voor MALDI-TOF MS analyse. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Workflow voor de bereiding van de monsters van verdeelde coculture. (A) Cut tabbladen uit media bekken (~ 13 mm) en ervoor zorgen dat zijden rechte. (B) bijvoegen 8-well kamer naar geleidende kant van de ITO-gecoate slide. (C) invoegen scheidingslijnen diagonaal in putten. (D) toevoegen 150 µL celcultuur in agarose aan één kant van de scheidingslijn, toestaan agarose afkoelen en verwijder divider. (E) toevoegen eierstok naar midden van lege goed half en cover met 150 µL van media en agarose schorsing. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Zink et al. 201816. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: rimpels in agarose stekkers. Rimpels kunnen vormen in de agarose stekkers als de dia wordt gelaten in de oven te lang. Dit zal geen beletsel voor het monster uit MALDI-TOF MS analyse maar kan invloed hebben op de kwaliteit van de gegevens. (A) afbeelding van een optimaal gedroogde dia. De omringende het eierstokweefsel agarose alles volledig plat en vrij van rimpels, voldoende ruimte te voorzien van IMS analyse. (B) afbeelding van een slecht gedroogde dia met gerimpelde agarose in het monster. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Zink et al. 201816. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: positionering van weefsel. Positie van weefsel in gedroogde monster is zeer belangrijk voor data-acquisitie. (A) gedroogde agarose stekkers van verdeelde kamers tonen de eierstok in het midden van een helft van de put, die optimaal is voor de beeldvorming. (B) gedroogd agarose stekkers van verdeelde kamer waar eierstok was niet gecentreerd voor incubatie of drogen. De eierstokweefsel gedroogd op de omtrek van het agarose stekkers, en daarom niet kan worden geanalyseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: dia's met de kamer drogen. Wanneer de dia wordt ingesteld in de oven voorafgaand aan verwijdering van de kamer, de stekkers agarose sterker te houden aan het plastic dan aan zichzelf en beginnen te trekken uit elkaar in de hitte. Dit leidt tot ernstige barsten in de agarose en weinig hechting aan de dia zelf. Dit grote scheuren zijn niet bevorderlijk voor IMS analyse. Top: Schuif na 2U uitdroging met 8-well kamer nageleefd. Alle agarose stekkers maar twee gekraakt door het midden als gevolg van de hechting op de kamer 8-well. Bodem: Schuif na verwijdering van 8-well kamer. Slechts één agarose plug bleef op de dia. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Zink et al. 201816. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: unieke signalen opsporen. Bij het vergelijken van 8 voorwaarden, is het mogelijk om te detecteren signalen die uniek voor één enkele voorwaarde zijn. (A) de gedroogde dia-afbeelding wordt gebruikt om te leren de MALDI-TOF massa spectrometer welke regio's om het imago. Wij hebben hier kleine regio's rond de eierstokweefsel geselecteerd voor IMS op 50 µm. (B) A representatief beeld van een m/z -signaal dat is upregulated in één voorwaarde ten opzichte van alle acht op dezelfde dia.. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: representatieve gegevens van verdeelde kamer setup. Eierstokweefsel is uiteengezet in wit. De m/z 112 is afgescheiden van de helft van het putje met het ovarium. IMS werd uitgevoerd in 50 µm. Deze afbeelding is gereproduceerd met toestemming van Zink et al. 201816. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er is een groeiend lichaam van bewijsmateriaal dat noradrenaline de rol in HGSOC12,17,18 impliceert, en deze techniek meer mechanistische informatie heeft bijgedragen. Met ten minste acht biologische omstandigheden aanwezig op dezelfde dia, kan de methode goed zijn voor biologische besturingselementen zoals gen, evenals cel specificiteit en controles van de media in een enkele IMS uitvoeren. Terwijl de methode is geoptimaliseerd om te evalueren uitgewisseld kleine moleculen in een model van primaire metastase in HGSOC, een willekeurige cel of weefseltype dat kan worden geplaatst in de agarose kan worden vervangen voor het analyseren van een breed scala aan biologische vragen en ziekte staten.
Een van de belangrijkste stappen in het protocol is ervoor te zorgen dat de weefsels of cellen typen dicht bij elkaar zijn en aanwezig in het midden van de agarose stekker zijn. Een andere belangrijke overweging is optimalisatie van de droogtijd van de hele dia. Deze methode was geoptimaliseerd door het gebruik van eierstokweefsel, die gemakkelijk gedroogd en waarvan de kleine grootte resulteerde in kleine Droogrek complicaties. Echter andere weefsels, met verschillende compositie zoals vet, hebben zeer verschillende drogen profielen en daarom vereisen meer uitgebreide uitdroging optimalisatie. Na het drogen is geoptimaliseerd voor de biologische steekproef, mocht de resterende workflow alleen minimale wijziging.
Tijdens de massa spectrale acquisitie is het waarschijnlijk dat vele projecten de analyse van de samengestelde groepen dan kleine moleculen vergt. De IMS-parameters voor de overname en de selectie van matrix, moeten daarom worden aangepast voor het genereren van de beste gegevens voor het desbetreffende doel, als het bekend is. Bovendien we hebben alleen data-acquisitie uitgevoerd op positieve wijze met een 50:50 CHCA:DHB matrix, maar negatieve modus experimenten misschien liever een ander type van matrix, en grotere moleculen gemakkelijker zou worden gedetecteerd in een verschillende matrix zo goed. De methode kan worden gebruikt met een brede massa bereik in een irrelevante aanpak of met een smaller massa bereik voor een gerichte zoekactie. In het geval van de hierboven besproken methode waren kleine molecules het doelwit van belang omdat de focus te detecteren van moleculen die via de agarose tussen vertegenwoordigers van de cel- en weefseltransplantaties werden uitgewisseld. Hoewel wij niet dat de beperkingen in termen van omvang en structuur die een remmende werking van verkeer via agarose beweren, was ons doel te sporen van kleine molecules, zodat onze beschikking van de matrix en de MALDI-TOF MS parameters werden geoptimaliseerd voor dat doel. Toekomstige experimenten worden ontwikkeld om te richten van lipiden en eiwitten die in onze oorspronkelijke aankoop-methode kunnen hebben gemist.
Naast de beperking van de samengestelde klassedetectie vereist deze methode ook dat de cellen zijn compatibel met agarose, en dat het monster van het weefsel (indien gebruikt) worden aangepast om te passen in een acht-well-kamer. Bepaalde weefsels kunnen worden aangepast aan de grotere wells als minder biologische omstandigheden vereist voor de vergelijking zijn, maar het is van cruciaal belang dat de geselecteerde weefsel staat voor het drogen een uniforme hoogte van minder dan 100 tot 200 µm na opdroging4is. Meerdere biologische monsters kunnen worden geëvalueerd als meer dan één celtype in communicatie met een tissue. Omdat de monsterverwerking vermag ruimtelijk scheiden agarose gebaseerde celculturen, is het mogelijk om toewijzen gevisualiseerd m/z 's naar de cel cultuur bron op basis van de waargenomen diffusie patronen.
Met behulp van IMS studie van weefselsecties uit menselijke specimens of transgene muismodellen recapituleert de complexiteit van de weefsels. Menselijke specimens zijn echter moeilijk te verkrijgen, die kan drastisch beperken de mogelijkheid te bestuderen van dingen zoals progressie van de ziekte. Weefsel van transgene muismodellen kan worden verzameld op welbepaalde tijdstippen. Maar, Muismodellen kunnen tijdrovend en duur om te ontwikkelen. Bovendien, kan de volledige complexiteit van echte weefsels in beide modellen het moeilijk maken om te nauwkeurig evalueren communicatie tussen bepaalde cellen of weefsels. De methode die hier gepresenteerd is daarentegen een hoogst aanpasbaar. Verschillende weefsels of cellijnen kunnen worden cocultured op dezelfde dia. te bestuderen van de verschillen in communicatie. Normale cellen of tumorcellen uit de dezelfde weefsel kunnen bijvoorbeeld worden gekweekt op dezelfde dia. te begrijpen van de verschillen als gevolg van de transformatie. Tijd cursus studies kunnen ontdekken nieuwe signalering cascades tussen cellen of klein molecuul remmers en/of RNAi kan worden opgenomen om de rol van specifieke signalering moleculen of metabolieten te onderzoeken. Wij zijn van mening dat deze mogelijkheden zal deze techniek handig voor het bestuderen van cel naar cel communicatie in een breed scala van contexten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
Financiering werd verstrekt door het Consortium Chicago biomedische met steun van de fondsen van de Searle op The Chicago Gemeenschap Trust (C-076) (L.M.S.); Universiteit van Illinois te Chicago opstarten middelen (L.M.S.); Subsidie 543296 van de ovariële kanker onderzoek Fonds Alliantie (M.D.); en UG3 ES029073 (J.E.B.) en door het National Center for Advancing translationeel Sciences, National Institute of Health, door middel van subsidie UL1TR002003 (JEB & LMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Falcon tubes | Denville | C1017-O | To collect cells |
| 8-well chamber (Millipore EZ-slide chamber) | Millipore | PEZGS0816 | Repurposed from Millipore Millicell EZ-slide chamber slide |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998-4L | Solvent for sprayed matrix |
| Alpha Minimum Essential Medium (αMEM) | Fisher | 10-022-CV | Cell culture media |
| Autoflex speed MALDI-TOF LRF | Bruker | For IMS data analysis | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | To collect cells and remove supernatant |
| CHCA Matrix | Bruker Daltonic | 8201344 | Matrix sprayed onto dried slide |
| DHB Matrix | Bruker Daltonic | 8201346 | Matrix sprayed onto dried slide |
| Disposable Scalpels | Fisher | 22-079-707 | For removal of the ovaries |
| Dissecting Scissors | Fisher | 13-804-6 | For removal of the ovaries |
| DMEM Media | Gibco | 11995-065 | Media mixed with agarose |
| epidermal growth factor | Peprotech Inc. | 100-15 | Cell culture media supplement |
| Eppendorf tubes | Genesee Scientific | 22-282 | For agarose aliquots |
| Estradiol-17β | Simga-Aldrich | E2758 | Cell culture media supplement |
| Fetal Bovine Serum | Denville | fb5001 | Cell culture media supplement |
| FlexControl 3.4 | Bruker Daltonic | IMS data acquisition software | |
| FlexImaging 4.1 | Bruker Daltonic | IMS data analysis software | |
| Forceps (fine) | Fsiher | 22-327379 | For removal of the ovaries |
| Gentamycin | Cellgro | 30-005-CR | Cell culture media supplement |
| Insulin, Transferrin, Selenium (ITS) | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Cell culture media supplement |
| ITO-coated slide | Bruker | 8237001 | Platform for co-culture incubation |
| Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 11415064 | Media used during tissue dissection |
| L-glutamine | Gibco | 25030-081 | Cell culture media supplement |
| Low-melting agarose | Sigma-Aldrich | A9414-10G | Mixed with media for plating |
| Media basin | Corning | 4870 | Used to cut plastic dividers for divided chambers |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | Cell culture media supplement |
| Peptide Calibration Standard | Bruker Daltonic | 8206195 | Calibrant for medium mass range |
| Phophorus red | Sigma-Aldrich | 343-242-5G | Calibrant for low mass range |
| SCiLS Lab 2015 | Bruker Daltonic | IMS data statistical analysis | |
| Surgical Forceps (blunt) | Fisher | 08-875-8B | For removal of the ovaries |
| TFA | Fisher Technologies | A116-50 | Added to matrix solution |
| TM Sprayer | HTX Technologies | For applying matrix |
References
- Paine, M. R., et al. Whole Reproductive System Non-Negative Matrix Factorization Mass Spectrometry Imaging of an Early-Stage Ovarian Cancer Mouse Model. PLoS One. 11 (5), e0154837 (2016).
- Yang, Y. L., Xu, Y., Straight, P., Dorrestein, P. C. Translating Metabolic Exchange with Imaging Mass Spectrometry. Nature Chemical Biology. 5 (12), 885-887 (2009).
- Li, H., Hummon, A. B. Imaging Mass Spectrometry of Three-Dimensional Cell Culture Systems. Analytical Chemistry. 83 (22), 8794-8801 (2011).
- Yang, J. Y., et al. Primer on Agar-Based Microbial Imaging Mass Spectrometry. Journal of Bacteriology. 194 (22), 6023-6028 (2012).
- Coscia, F., et al. Integrative Proteomic Profiling of Ovarian Cancer Cell Lines Reveals Precursor Cell Associated Proteins and Functional Status. Nature Communications. 7, 12645 (2016).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High Grade Serous Ovarian Carcinomas Originate in the Fallopian Tube. Nature Communications. 8 (1), (2018).
- Klinkebiel, D., Zhang, W., Akers, S. N., Odunsi, K., Karpf, A. R. DNA Methylome Analyses Implicate Fallopian Tube Epithelia as the Origin for High-Grade Serous Ovarian Cancer. Molecular Cancer Research. 14 (9), 787-794 (2016).
- Falconer, H., Yin, L., Gronberg, H., Altman, D. Ovarian Cancer Risk After Salpingectomy: A Nationwide Population-Based Study. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 107 (2), dju410 (2015).
- Dean, M., Davis, D. A., Burdette, J. E. Activin A Stimulates Migration of the Fallopian Tube Epithelium, an Origin of High-Grade Serous Ovarian Cancer, through Non-Canonical Signaling. Cancer Letters. 391, 114-124 (2017).
- King, S. M., Burdette, J. E. Evaluating the Progenitor Cells of Ovarian Cancer: Analysis of Current Animal Models. BMB Reports. 44 (7), 435 (2011).
- Reznik, E., et al. Landscape of Metabolic Variation across Tumor Types. Cell Systems. 6 (3), 301-313 (2018).
- Watkins, J. L., et al. Clinical Impact of Selective and Nonselective Beta-Blockers on Survival in Patients with Ovarian Cancer: Beta-Blockers and Ovarian Cancer Survival. Cancer. 121 (19), 3444-3451 (2015).
- Lutgendorf, S. K., et al. Stress-Related Mediators Stimulate Vascular Endothelial Growth Factor Secretion by Two Ovarian Cancer Cell Lines. Clinical Cancer Research. 9 (12), 4514-4521 (2003).
- Sood, A. K. Stress Hormone-Mediated Invasion of Ovarian Cancer Cells. Clinical Cancer Research. 12 (2), 369-375 (2006).
- Hoffmann, T., Dorrestein, P. C. Homogeneous Matrix Deposition on Dried Agar for MALDI Imaging Mass Spectrometry of Microbial Cultures. Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 26 (11), 1959-1962 (2015).
- Zink, K. E., Dean, M., Burdette, J. E., Sanchez, L. M. Imaging Mass Spectrometry Reveals Crosstalk between the Fallopian Tube and the Ovary That Drives Primary Metastasis of Ovarian Cancer. ACS Central Science. 4 (10), 1360-1370 (2018).
- Armaiz-Pena, G. N., et al. Src Activation by β-Adrenoreceptors Is a Key Switch for Tumour Metastasis. Nature Communications. 4, 1403 (2013).
- Choi, M. J., et al. HTERT Mediates Norepinephrine-Induced Slug Expression and Ovarian Cancer Aggressiveness. Oncogene. 34 (26), 3402 (2015).
