Indurre la parodontite apicale nei topi
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per indurre localmente la parodontite apicale nei topi. Mostriamo come praticare un foro nel dente del topo ed esporre la sua polpa, al fine di causare infiammazione locale. Sono inoltre dimostrati metodi di analisi per studiare la natura di questa infiammazione, come la micro-TC e l’istologia.
Abstract
I meccanismi coinvolti nell’infiammazione indotta locale possono essere studiati utilizzando diversi modelli animali disponibili. Uno di questi è l’induzione della parodontite apicale (AP). La parodontite apicale è una patologia comune di natura infiammatoria nei tessuti parodontali che circondano la radice del dente. Al fine di comprendere meglio la natura e il meccanismo di questa patologia è vantaggioso eseguire la procedura nei topi. L’induzione di questa infiammazione odontogenica si ottiene perforando il dente del topo fino a quando la polpa dentale è esposta. Successivamente, la polpa del dente rimane esposta per essere contaminata dalla flora orale naturale nel tempo, causando parodontite apicale. Dopo questo periodo di tempo, l’animale viene sacrificato e il dente e l’osso mascellare possono essere analizzati in vari modi. Le analisi tipiche includono la risonanza micro-TC (per valutare la risurrezione ossea), la colorazione istologica, l’immunoistochimica e l’espressione dell’RNA. Questo protocollo è utile per la ricerca nel campo della biologia orale per comprendere meglio questo processo infiammatorio in un ambiente sperimentale in vivo con condizioni uniformi. La procedura richiede un’attenta manipolazione dei topi e della mascella isolata, e una dimostrazione visiva della tecnica è utile. Sono dimostrati tutti gli aspetti tecnici delle procedure che portano alla parodontite apicale indotta e la sua caratterizzazione in un modello murino.
Introduction
L’obiettivo di questo metodo è quello di indurre la parodontite apicale in un topo contaminando l’apice con la microflora naturale, e poi studiare varie caratteristiche di questo processo patologico.
La parodontite apicale (AP) è una patologia comune di natura infiammatoria nei tessuti parodontali che circondano la radice del dente. Questa malattia dentale può causare forti dolori e deve essere trattata da un dentista. Le opzioni di trattamento includono il trattamento del canale radicale (primario o secondario), la chirurgia endodontica, l’estrazione dei denti o il follow-up a seconda dei risultati clinici e radiografici e il parere del medico. Il meccanismo di questo processo infiammatorio, anche se studiato per diversi decenni1,2,3, non è ancora ampiamente compreso. Considerando la gravità di questa patologia, c’è quindi una chiara necessità di ricerca che affronti la sua natura fondamentale. Così, i sistemi in cui lo studio dell’AP è possibile sono di grande interesse scientifico.
Poiché l’AP è un processo patologico complesso che coinvolge i tessuti locali e il sistema immunitario, gli studi in vitro sono insufficienti per una comprensione completa dei processi. Lo studio di campioni clinici di questa malattia sono anche problematici a causa di limitazioni etiche e significativa variabilità tra persone diverse e diversi stadi clinici4,5, e quindi la necessità di modelli in vivo. Questi modelli si basano sul concetto di esporre la polpa dentale alla contaminazione e osservare la reazione infiammatoria del corpo a questo stimolo nei tessuti periacali6,7. Modelli in vivo comuni includono roditori o animali più grandi come i cani. Nonostante la sfida clinica nel trattamento dei topi, che sono animali molto piccoli con denti in miniatura, i vantaggi del modello murino sono significativi: praticamente, lavorare con i topi è tecnicamente semplice in termini di strutture ed è più conveniente, e scientificamente, il topo è un modello animale ben studiato con strumenti genetici e molecolari prontamente disponibili e un genoma ben studiato. Infatti, studi precedenti hanno utilizzato un modello murino per studiare i segnali di rinrpzione infiammatoria e ossea e le cellule coinvolte nella parodontite apicale8,9,10,11. Pertanto, è necessario un protocollo chiaro su come utilizzare un modello di mouse per lo studio di AP. Qui, descriviamo un tale protocollo.
Il protocollo qui descritto ha il grande vantaggio di essere appropriati per studiare i topi knock-out (KO) e imparare come la mancanza di un gene specifico colpisce l’infiammazione dentale7,12. Altre applicazioni utili di questo protocollo includono lo studio degli effetti dei farmaci e delle condizioni sistemiche sullo sviluppo della parodontite apicale13, l’effetto della parodontite apicale sullo sviluppo dell’osteonecrosi delle mascelle14 , 15 e terapia con cellule staminali per la rigenerazione ossea16.
Questo protocollo può anche essere generalizzato come un modello per studiare l’infiammazione locale. Per studiare il processo infiammatorio, sono stati sviluppati diversi modelli murini, che includono ad esempio la colite indotta o l’artrite17,18. Questi modelli hanno effetti sistemici e non hanno alcun controllo incorporato nello stesso animale. I modelli per la parodontite apicale indotta, che includono un controllo contralaterale senza infiammazione, hanno il vantaggio di superare queste limitazioni14,19.
Il protocollo descritto di seguito è quindi utile per i ricercatori che sono interessati ai processi infiammatori locali. La natura controllata di questa infiammazione, il suo confinamento in un luogo specifico e il dente di controllo contralaterale, rendono questo protocollo prezioso per studiare i meccanismi coinvolti in questo processo. Inoltre, il protocollo è utile per i ricercatori interessati agli aspetti clinici dell’infiammazione periapica. Il modello murino è ideale per studiare diverse variabili della malattia, oltre al vantaggio di essere in grado di eseguire facilmente manipolazioni genetiche nel modello murino, per studiare l’attività di geni specifici nell’infiammazione periapica.
Tecnicamente, la procedura clinica è difficile da eseguire a causa delle piccole dimensioni dei denti dei topi. Sarà utile visualizzare questa procedura per conoscere il posizionamento, l’attrezzatura necessaria e le prestazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un metodo è introdotto qui per l’induzione della parodontite apicale nei topi. L’obiettivo del metodo è quello di sfruttare la condizione di parodontite apicale per studiare i meccanismi e le conseguenze di questo processo infiammatorio. La parodontite apicale è stata indotta in topi di 6-8 settimane, un’età in cui le radici sono completamente sviluppate24. Al fine di causare parodontite apicale in questo modello, la polpa del dente di molari mandibolici di topo è esposta utilizz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere il Dr. Oded Heyman per il suo aiuto con il posizionamento degli animali, Raphael Lieber per l’aiuto con l’analisi micro-CT, e il prof. Vorremmo anche riconoscere il Dr. Sidney Cohen per la lettura critica e l’editing.
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Dr. Izador I. Cabakoff Research Endowment Fund a MK e IA, e da una borsa di studio Yitzhak Navon del Ministero della Scienza e della Tecnologia di Israele a EG.
Materials
| Atipamezole hydrochloride | Eurovet Animal Health | CAS 104075-48-1 | |
| ATR | dentsply | tecnika | |
| blocking machine | Leica | EG1150H | |
| buprenorphine | vetmarket | 163451 | |
| clinical microscope/binocular | Olympus | Sz61 | |
| dental bur | Komet dental | ZR8801L 315 008 | |
| dental spatula | Premier | 1003737 | |
| EDTA | J.T Baker | 8993 | |
| entelan | mercury | 1.07961 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | SIGMA | HT110116 | |
| hematoxylin solution, Mayer's | SIGMA | MHS 16 | |
| Ketamine hydrochloride | Vetoquinol | CAS 1867-669 | |
| Medetomidine hydrochloride (cepetor) | CP-pharma GmbH | CAS 86347-15-1 | |
| Mepivacaine HCl 3% | Teva | CAS 96-88-8 | |
| microbrushes- adjustable precision applicators | PARKELL | S379 | |
| micro-ct scanner | scanco | uCT 40 | |
| parafin | Leica | 39602004 | |
| PBS | SIGMA | D8537 | |
| PFA | EMS | 15710 | |
| Chloramphenicol eye ointment (5%) | Rekah pharmaceutical | CAS 56-75-7 | |
| tweezers | WAM | Ref-CT | |
| xylazine | Eurovet Animal Health | CAS 7361-61-7 | |
| xylene | Gadot | CAS 1330-20-7 |
Riferimenti
- Azuma, M. M., Samuel, R. O., Gomes-Filho, J. E., Dezan-Junior, E., Cintra, L. T. The role of IL-6 on apical periodontitis: a systematic review. International Endodontics Journal. 47 (7), 615-621 (2014).
- Marton, I. J., Kiss, C. Overlapping protective and destructive regulatory pathways in apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (2), 155-163 (2014).
- Graunaite, I., Lodiene, G., Maciulskiene, V. Pathogenesis of apical periodontitis: a literature review. Journal of Oral and Maxillofacial Research. 2 (4), e1 (2012).
- Hussein, F. E., Liew, A. K., Ramlee, R. A., Abdullah, D., Chong, B. S. Factors Associated with Apical Periodontitis: A Multilevel Analysis. Journal of Endodontics. 42 (10), 1441-1445 (2016).
- Takahashi, K., MacDonald, D. G., Kinane, D. F. Analysis of immunoglobulin-synthesizing cells in human dental periapical lesions by in situ hybridization and immunohistochemistry. Journal of Oral Pathology Medicine. 25 (6), 331-335 (1996).
- Lin, D., et al. Enterococcus faecalis lipoteichoic acid regulates macrophages autophagy via PI3K/Akt/mTOR pathway. Biochemical and Biophysical Research Community. 498 (4), 1028-1036 (2018).
- Wu, Y., Sun, H., Yang, B., Liu, X., Wang, J. 5-Lipoxygenase Knockout Aggravated Apical Periodontitis in a Murine Model. Journal of Dental Research. 97 (4), 442-450 (2018).
- Barreiros, D., et al. Immunohistochemical and mRNA expression of RANK, RANKL, OPG, TLR2 and MyD88 during apical periodontitis progression in mice. Journal of Applied Oral Science. 26, e20170512 (2018).
- Barreiros, D., et al. MMP2 and MMP9 are Associated with Apical Periodontitis Progression and Might be Modulated by TLR2 and MyD88. Brazillian Dentistry Journal. 29 (1), 43-47 (2018).
- Virtej, A., Papadakou, P., Sasaki, H., Bletsa, A., Berggreen, E. VEGFR-2 reduces while combined VEGFR-2 and -3 signaling increases inflammation in apical periodontitis. Journal of Oral Microbiology. 8, 32433 (2016).
- De Rossi, A., et al. Cementocytes Express Receptor Activator of the Nuclear Factor Kappa-B Ligand in Response to Endodontic Infection in Mice. Journal of Endodontics. 42 (8), 1251-1257 (2016).
- Rider, D., et al. Elevated CD14 (Cluster of Differentiation 14) and Toll-Like Receptor (TLR) 4 Signaling Deteriorate Periapical Inflammation in TLR2 Deficient Mice. Anatomy Records (Hoboken). 299 (9), 1281-1292 (2016).
- Martins, C. M., Sasaki, H., Hirai, K., Andrada, A. C., Gomes-Filho, J. E. Relationship between hypertension and periapical lesion: an in vitro and in vivo study. Brazillian Oral Research. 30 (1), e78 (2016).
- Rao, N. J., Wang, J. Y., Yu, R. Q., Leung, Y. Y., Zheng, L. W. Role of Periapical Diseases in Medication-Related Osteonecrosis of the Jaws. Biomedical Research International. 2017, 1560175 (2017).
- Song, M., et al. Preexisting Periapical Inflammatory Condition Exacerbates Tooth Extraction-induced Bisphosphonate-related Osteonecrosis of the Jaw Lesions in Mice. Journal of Endodontics. 42 (11), 1641-1646 (2016).
- Wu, Y., et al. Hypoxic Preconditioning Enhances Dental Pulp Stem Cell Therapy for Infection-Caused Bone Destruction. Tissue Engineering Part A. 22 (19-20), 1191-1203 (2016).
- Eichele, D. D., Kharbanda, K. K. Dextran sodium sulfate colitis murine model: An indispensable tool for advancing our understanding of inflammatory bowel diseases pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 23 (33), 6016-6029 (2017).
- Choudhary, N., Bhatt, L. K., Prabhavalkar, K. S. Experimental animal models for rheumatoid arthritis. Immunopharmacology and Immunotoxicology. 40 (3), 193-200 (2018).
- Shah, A., et al. Clastic cells are absent around the root surface in pulp-exposed periapical periodontitis lesions in mice. Oral Disease. 24 (1-2), 57-62 (2018).
- Wan, C., et al. MMP9 deficiency increased the size of experimentally induced apical periodontitis. Journal of Endodontics. 40 (5), 658-664 (2014).
- Bezerra da Silva, R. A., et al. MyD88 knockout mice develop initial enlarged periapical lesions with increased numbers of neutrophils. International Endod Journal. 47 (7), 675-686 (2014).
- Mehrazarin, S., Alshaikh, A., Kang, M. K. Molecular Mechanisms of Apical Periodontitis: Emerging Role of Epigenetic Regulators. Dental Clinics of North America. 61 (1), 17-35 (2017).
- Metzger, Z. Macrophages in periapical lesions. Endodontics Dentisrty and Traumatology. 16 (1), 1-8 (2000).
- Lungova, V., et al. Tooth-bone morphogenesis during postnatal stages of mouse first molar development. Journal of Anatomy. 218 (6), 699-716 (2011).
- Zilberstein, L. F., Moens, Y. P., Leterrier, E. The effect of local anaesthesia on anaesthetic requirements for feline ovariectomy. Veterinary Journal. 178 (2), 214-218 (2008).
- Kaufman, E., Epstein, J. B., Gorsky, M., Jackson, D. L., Kadari, A. Preemptive analgesia and local anesthesia as a supplement to general anesthesia: a review. Anesthesia Progress. 52 (1), 29-38 (2005).
- Song, M., et al. Development of a Direct Pulp-capping Model for the Evaluation of Pulpal Wound Healing and Reparative Dentin Formation in Mice. Journal of Visual Experimentalization. (119), (2017).
- Yoneda, N., et al. Development of a root canal treatment model in the rat. Scientific Reports. 7 (1), 3315 (2017).
- AlShwaimi, E., et al. Regulatory T cells in mouse periapical lesions. Journal of Endodontics. 35 (9), 1229-1233 (2009).
