Fare Beyin Dilimlerinde Uzun Menzilli Girdilerin Optogenetik Stimülasyonu için Vivo İntraserebral Stereotaksik Enjeksiyonlarda
Summary
Bu protokol, ex vivo beyin dilimlerinde optogenetik stimülasyonlar kullanarak uzak beyin bölgelerinden gelen uzun menzilli girdilerin hücre tipi spesifik fonksiyonel bağlantısını belirlemek için bir dizi yöntemi açıklamaktadır.
Abstract
Hücre tipi spesifik sinaptik bağlantı bilgisi, beyin çapındaki nöronal devreleri anlamak için çok önemli bir ön koşuldur. Uzun menzilli bağlantıların fonksiyonel incelemesi, tanımlanan uzak girdilerin spesifik uyarılmasıyla birlikte tek nöronların hedefli kayıtlarını gerektirir. Bu genellikle geleneksel ve elektriksel stimülasyon teknikleri ile elde etmek zordur, yukarı beyin bölgelerinde yakınsama aksonhedef bölgede iç içe olabilir, çünkü. Işığa duyarlı iyon kanallarının virüs aracılı ekspresyonu için belirli bir beyin bölgesinin stereotaksik hedeflemesi, o bölgeden gelen aksonun ışıkla seçici olarak uyarılmasını sağlar. İntraserebral stereotaksik enjeksiyonlar beyin deki diğer subkortikal veya kortikal alanlara ek olarak, anterior talamik çekirdekleri gibi iyi delimited yapılarda kullanılabilir.
Burada açıklanan fare beyninde channelrhodopsin ifade viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyon için teknikler bir dizi, beyin dilimi hazırlanmasında akson terminalleri fotostimülasyon takip. Bu protokoller basit ve yaygın olarak uygulanabilir. Postsynaptically bağlı nöron dan tam hücre yama kıskaç kaydı ile birlikte, aksonların fotostimülasyon fonksiyonel sinaptik bağlantıların tespiti sağlar, farmakolojik karakterizasyon, ve güçlerinin değerlendirilmesi. Buna ek olarak, kaydedilen nöronun biyositin dolgu postinaptik nöronun post-hok morfolojik belirlenmesi için kullanılabilir.
Introduction
Beyin bölgeleri arasındaki bağlantıyı tanımlamak nöral devreleri anlamak için gereklidir. Klasik anatomik izleme yöntemleri bölgelerarası bağlantının kurulmasına olanak sağlarken, lezyon çalışmaları bilgi akışının hiyerarşik organizasyonunu anlamaya yardımcı olur. Örneğin, uzamsal oryantasyon ve baş yön sinyali için beyin devreleri, talamustan presubiculuma kadar olan bilginin yön akışını içerir. Bu antero-dorsal talamik çekirdeklerin lezyon çalışmaları ile gösterilmiştir (ADN) downstream dorsal presubiculum baş yön sinyalini bozan, yanı sıra parahipokampal ızgara hücre sinyali1,2.
Beyin bölgeleri arasındaki fonksiyonel bağlantı hücresel ve hücre altı düzeyde kurmak daha zordur. Hipokampus, son derece organize anatomi dilim hazırlanmasında elektrik simülasyonu kullanarak yola özgü sinaptik bağlantıları araştırmak için izin verir. CA1’in stratum radyatumuna yerleştirilen stimülasyon elektrotları özellikle CA33’tenSchaffer teminat girdisini uyarmak için kullanılabilir. CA1’in stratum lacunosum molekülerine yerleştirilen uyarıcı elektrotlar, CA14,5’eperforant yol girişini aktive edecektir. Elektriksel stimülasyon akson terminallerinden nörotransmitter salınımı aktive; ancak, stimülasyon bölgesine yakın somata ile nöronlar aktive yanı sıra geçiş aksonları. Bu nedenle, neokortekste olduğu gibi, farklı orijin bölgelerinden liflerin hedef yapıda iç içe geçtiğinde, tanımlanmış beyin bölgelerinden gelen afferentlerin incelenmesinde sınırlı kullanım söz konusudur.
Nöronlar da ışık ile uyarılabilir. Optik yöntemler kafesli glutamat fotoaktivasyonu içerir, hangi bir kombine edilebilir- veya iki foton lazer tarama. Birden fazla yakın aralıklı siteler ardışık olarak uyarılabilir, doku hiçbir mekanik hasar ile6. Bu başarıyla sinaptik reseptörleri harita yanı sıra bireysel nöronlaretkinleştirmekiçin kullanılmıştır 7 . Glutamat uncaging yerel devre analizi için kullanılabilir iken, uzun menzilli girişlerin özel aktivasyonu için izin vermez.
Nöronal devrelerde uzun menzilli bağlantının araştırılması için tercih edilen bir yöntem virüs aracılı kanalrhodopsin ekspresyonu kullanımıdır. Burada açıklandığı gibi in vivo stereotaksik enjeksiyonlar kullanılarak, ışık kapılı iyon kanallarının ifadesi hedeflenebilir ve mekansal olarak istenilen beyin bölgesi ile sınırlı olabilir. Bu şekilde, kanaloidpsinler bir bölgeden hedefine uyarıcı veya inhibitör bağlantı haritalama için etkilidir. Transfected akson terminalleri bir beyin dilimi hazırlık ışık ile uyarılabilir, ve yama-kelepçe kayıtları bir okuma olarak beyindeki belirli devre bileşenlerinin işlevleri ve güçlü lerinin incelenmesine izin8. Optogenetik yaklaşım bir virüsün stereotaksik enjeksiyonu ile birlikte benzeri görülmemiş özgüllük ve genetik kontrol sunuyor9. Ayrıca ışık ile uyarıcı hem yüksek zamansal ve mekansal hassasiyet10,11sağlar.
Presubiculum hipokampus geçiş altı katmanlı kortikal yapı ve para-hipokampal oluşumu12,13. ADN11’den önemli sinaptik giriş alır, aynı zamanda diğer birçok kortikal ve subkortikal bölgeden14. Bu nedenle, bir presubiküler dilim içinde talamik aksonlar terminallerinin seçici stimülasyon elektriksel stimülasyon veya glutamat uncaging ile mümkün değildir. Bu protokolde açıklanan yöntem, ışık kapılı kanalları ifade eden viral vektörlerin hassas stereotaksik enjeksiyonları kullanılarak beyin bölgeleri (ADN ve presubiculum) arasındaki fonksiyonel bağlantıyı belirleme yöntemleridir. Ayrıca açıklanan kendi hedef bölgede nöronlar projektör aksonların terminalleri fotostimülasyon, beyin dilimi hazırlanmasında post-sinaptik nöronların tüm hücre yama-kelepçe kayıtları ile birleştiğinde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tanımlanmış bir beyin bölgesinde ışığa duyarlı opsinler ifade etmek için in vivo viral enjeksiyon uzun menzilli fonksiyonel bağlantı10optogenetik analizi için bir seçim yöntemidir,11,17,18. Stereotaksik enjeksiyonlar tam olarak beynin belirli bir alanı hedef imkanı sunuyoruz. Floresan bir muhabir ile bir opsin coexpression uygun başarılı ifade ve kesin enjeksiyon sitenin ona…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bertrand Mathon, Mérie Nassar, Li-Wen Huang ve Jean Simonnet’e stereotaksik enjeksiyon protokolünün önceki sürümlerinin geliştirilmesinde yardımcı olmaları için teşekkür ederiz ve Marin Manuel ve Patrice Jegouzo teknik yardım için. Bu çalışma Fransa Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (L. R., L. S.), Centre National des Etudes Spatiales (M. B.) ve Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-18-CE92-0051-01 (D. F.) tarafından desteklendi.
Materials
| 0.5 mm bur | Harvard Apparatus | 724962 | |
| 10 µL Hamilton syringe | Hamilton | 1701 RN – 7653-01 | |
| 10X PBS solution | Thermofisher Scientific | AM9624 | text |
| 36% PFA | Sigma-Aldrich | F8775 | |
| 470 nm LED | Cairn Research | P1105/470/LED DC/59022m | use with matched excitation filter 470/40x and emission filter for GFP |
| AAV5.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Penn Vector Core | AV-5-PV3446 | lot V6026R, qTiter GC/ml 4.912e12, ddTiter GC/ml 2.456e13 |
| All chemicals | Sigma | ||
| Bath temperature controler | Luigs & Neumann | SM7 | Set at 34°C |
| beveled metal needle | Hamilton | 7803-05 | 33 gauge, 13mm, point style 4-20° |
| Big scissors | Dahle Allround | 50038 | |
| Biocytin | Sigma | B4261 | final 1-3 mg/ml |
| Borosilicate Capillaries | Havard Apparatus | GC150-10 | 1.5 mm outer, 0.86 inner diameter |
| Brown Flaming electrode puller | Sutter Instruments | P-87 | |
| BupH Phosphate Buffered Saline pack | Thermofisher Scientific | 28372 | |
| butterfly needle for perfusion | Braun | Venofix A | 24G |
| CCD Camera | Andor | DL-604M | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM710 | 20X |
| curved forceps | FST | 11011-17 | |
| CY5 configuration (confocal) | Helium-Neon 633nm (5,0 mW) laser; Mirror: MBS 488/561/633 | ||
| CY5 configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Excitation filter: BP645/30; Dichroic mirror: 89100 BS ; Emission filter: BP705/72 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| DAPI configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Semrock Set DAPI-5060C-000-ZERO (Excitation: BP 377/50; Mirror: BS 409; Emission: BP 447/60) | |
| Digidata 1440A | Axon Instruments | ||
| Digital handheld optical meter | ThorLabs | PM100D | Parametered on 475 nm |
| Double egde stainless steel razor blades | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Use half of the blade in the slicer |
| Dual Fluorescent Protein Flashlight | Nightsea | DFP-1 | excitation, 440-460 nm; emission filter on glasses, 500 nm longpass. |
| EGTA | Sigma | E4368 | final 0,2 mM |
| Epifluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE-2000E | 10 or 20X |
| Filter paper | Whatman | ||
| Fluoro-Ruby 10% | Millipore | AG335 | disolve 10 mg in 100 µl of distilled water ; inject 150 to 300 nl |
| GFP configuration (epifluo) | Nikon/Chroma | Fluorescent light (Intensilight); Cube: Filter Set Nikon B-2E/C FITC (Excitation: BP 465-495; Mirror: BS 505; Emission: BP 515-555) | |
| Heatingplate | Physitemp | HP4M | |
| Heparin choay 5000 U.I./ml | Sanofi | 5 ml vial | |
| HEPES | Sigma | H3375 | final 10 mM |
| High speed rotary micromotor kit | Foredom | K.1070 | maximum drill speed 38,000 rpm |
| Internal solution compounds : | |||
| Isolated Pulse Stimulator | A-M Systems | 2100 | |
| KCl | Sigma | P4504 | final 1,2 mM |
| Ketamine 1000 | Virbac | ||
| Ketofen 10% | Merial | 100 mg/ml : dilute 1 µl in 1ml total (0,1%) | |
| Laocaine (lidocaine) | MSD | 16,22 mg/ml : dilute 1 ml in 4 ml total (around 4%) | |
| LED hi power spot for surgery | Photonic (via Phymep) | 10044 | |
| LED Power Supply | Cairn Research | OptoLED Light Source | |
| Manipulators | Luigs & Neumann | SM-7 | |
| Mg-ATP 2H20 | Sigma | A9187 | final 4 mM |
| MgCl2 | Sigma | 63069 | final 2 mM |
| Micro temperature controler | Physitemp | MTC-1 | |
| Milk powder | Carnation | ||
| MultiClamp 700B | Axon Instruments | ||
| Na Phosphocreatine | Sigma | P7936 | final 10 mM |
| Na3-GTP 2H20 | Sigma | G9002 | final 0.4 mM |
| needle holder/hemostat | FST | 13005-14 | |
| pClamp acquisition software | Axon Instruments | ||
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | 14-16 on the display for 2-3 ml/min |
| Potassium gluconate (K-gluconate) | Sigma | G4500 | Final 135 mM |
| ProLong Gold antifade mounting medium | Thermofisher Scientific | P36390 | |
| Rompun 2% (xylazine) | Bayer | ||
| small scissors | FST | 14060-09 | |
| Sodium chloride 0.9% | Virbac | dilute 8.5 mL in 10 ml total | |
| Stereomicroscope VISISCOPE SZT | VWR | 630-1584 | |
| Stereotaxic frame with digital display | Kopf | Model 940 | Small animal stereotaxic instrument |
| Streptavidin-Cy3 conjugate | Life technologies | 434315 | |
| Streptavidin-Cy5 conjugate | Thermofisher Scientific | S32357 | |
| Superglue3 Loctite | Dutscher | 999227 | 1g tube |
| Suture filament Ethilon II 4-0 polyamid | Ethicon | F3210 | |
| Syringe pump | kdScientific | Legato 130 – 788130 | Use Infuse and Withdraw modes |
| Tissue slicer | Leica | VT1200S | speed 0.07, amplitude 1. |
| tubing | Gilson | F117942, F117946 | Yellow/Black, Purple/Black |
| upright microscope | Olympus | BX51W1 | |
| Versi-dry bench absorbant paper | Nalgene |
Riferimenti
- Goodridge, J. P., Taube, J. S. Interaction between the postsubiculum and anterior thalamus in the generation of head direction cell activity. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 17 (23), 9315-9330 (1997).
- Winter, S. S., Clark, B. J., Taube, J. S. Spatial navigation. Disruption of the head direction cell network impairs the parahippocampal grid cell signal. Science. 347 (6224), 870-874 (2015).
- Fan, Y., et al. Activity-dependent decrease of excitability in rat hippocampal neurons through increases in I(h). Nature Neuroscience. 8 (11), 1542-1551 (2005).
- Takahashi, H., Magee, J. C. Pathway Interactions and Synaptic Plasticity in the Dendritic Tuft Regions of CA1 Pyramidal Neurons. Neuron. 62 (1), 102-111 (2009).
- Dolleman-van der Weel, M. J., Lopes da Silva, F. H., Witter, M. P. Interaction of nucleus reuniens and entorhinal cortex projections in hippocampal field CA1 of the rat. Brain Structure & Function. 222 (5), 2421-2438 (2017).
- Callaway, E. M., Yuste, R. Stimulating neurons with light. Current Opinion in Neurobiology. 12 (5), 587-592 (2002).
- Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, 2 (2009).
- Mao, T., et al. Long-range neuronal circuits underlying the interaction between sensory and motor cortex. Neuron. 72 (1), 111-123 (2011).
- Zhang, F., et al. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nature Protocols. 5 (3), 439-456 (2010).
- Simonnet, J., et al. Activity dependent feedback inhibition may maintain head direction signals in mouse presubiculum. Nature Communications. 8, 16032 (2017).
- Nassar, M., et al. Anterior Thalamic Excitation and Feedforward Inhibition of Presubicular Neurons Projecting to Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 38 (28), 6411-6425 (2018).
- Fricker, D., et al. Pyramidal cells of rodent presubiculum express a tetrodotoxin-insensitive Na+ current. The Journal of Physiology. 587, 4249-4264 (2009).
- Simonnet, J., Eugène, E., Cohen, I., Miles, R., Fricker, D. Cellular neuroanatomy of rat presubiculum. The European Journal of Neuroscience. 37 (4), 583-597 (2013).
- Simonnet, J., Fricker, D. Cellular components and circuitry of the presubiculum and its functional role in the head direction system. Cell and Tissue Research. 373 (3), 541-556 (2018).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2013).
- Huang, L. -. W., et al. Laminar Localization and Projection-Specific Properties of Presubicular Neurons Targeting the Lateral Mammillary Nucleus, Thalamus, or Medial Entorhinal Cortex. eNeuro. 4 (2), (2017).
- Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons. Neuron. 65 (2), 230-245 (2010).
- Gonzalez-Sulser, A., et al. GABAergic Projections from the Medial Septum Selectively Inhibit Interneurons in the Medial Entorhinal Cortex. Journal of Neuroscience. 34 (50), 16739-16743 (2014).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neuroscience Bulletin. 31 (6), 685-696 (2015).
- Nassar, M., et al. Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum. Frontiers in Neural Circuits. 9, 20 (2015).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Hass, C. A., Glickfeld, L. L. High-fidelity optical excitation of cortico-cortical projections at physiological frequencies. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2056-2066 (2016).
