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Cancer Research

छोटी बूंद डिजिटल ट्रैप (ddTRAP): छोटी बूंद डिजिटल Polymerase चेन रिएक्शन करने के लिए Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल के अनुकूलन

Published: May 3, 2019 doi: 10.3791/59550
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Kinesiology, University of Michigan

Summary

हम सफलतापूर्वक मानक telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) परख परिवर्तित करने के लिए छोटी बूंद डिजिटल पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रियाओं में कार्यरत हो । यह नई परख, ddtrap कहा जाता है, और अधिक संवेदनशील और मात्रात्मक है, बेहतर पता लगाने और विभिंन मानव कोशिकाओं के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति दी ।

Abstract

Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल (जाल) एक दिया एक नमूना के भीतर telomere गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया परख है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) आधारित विधि सबसे सेल lysates से एंजाइम गतिविधि के मजबूत माप के लिए अनुमति देता है । Fluorescently लेबल प्राइमरों के साथ जेल आधारित जाल नमूना throughput सीमा, और नमूनों में मतभेदों का पता लगाने की क्षमता दो गुना या एंजाइम गतिविधि में अधिक से अधिक परिवर्तन करने के लिए प्रतिबंधित है. छोटी बूंद डिजिटल जाल, ddtrap, एक अत्यंत संवेदनशील दृष्टिकोण है कि पारंपरिक जाल परख से संशोधित किया गया है, उपयोगकर्ता को सक्षम करने के लिए प्रति रन ९६ नमूनों पर एक मजबूत विश्लेषण करने के लिए और डीएनए के निरपेक्ष परिमाणन प्राप्त (telomerase विस्तार उत्पादों ) प्रत्येक पीसीआर के भीतर इनपुट । इसलिए, नव विकसित ddtrap परख पारंपरिक जेल आधारित जाल परख की सीमाओं पर काबू पा और एक अधिक कुशल, सटीक, और प्रयोगशाला और नैदानिक सेटिंग्स के भीतर टेलोमिरेज गतिविधि को मापने के लिए मात्रात्मक दृष्टिकोण प्रदान करता है ।

Introduction

Telomeres गतिशील डीएनए-रेखीय गुणसूत्र के सिरों पर प्रोटीन परिसरों हैं । मानव telomeres के एक सरणी से बना रहे है 5 '-TTAGGGn hexameric दोहराता है जो 12 के बीच लंबाई में अलग--15 किलोबाइट (kb) में जन्म1। मानव telomerase, ribonucleoprotein एंजाइम है कि telomerase का कहना है, सबसे पहले HeLa सेल lysates (कैंसर सेल लाइन)2में पहचाना गया था । साथ में, telomeres और telomeres जीनोम संरक्षण, जीन विनियमन, और कैंसर सेल अमरत्व3,4,5,6के रूप में जैविक प्रक्रियाओं के एक स्पेक्ट्रम में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं ।

मानव टेलोमिरेज मुख्य रूप से दो प्रमुख घटकों, अर्थात् टेलोमिरेज रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस और टेलोमिरेज आरएनए (htert और htert, क्रमशः) के शामिल है । प्रोटीन उपइकाई, hTERT, टेलोमेरेज एंजाइम के उत्प्रेरक के रूप में सक्रिय रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेस घटक है । आरएनए टेम्पलेट, hterc, टेलोमिरेज प्रदान करता है और विस्तार करने के लिए टेंपलेट के साथ/ अधिकांश मानव दैहिक ऊतकों का कोई detectable टेलोमेरेज क्रियाकलाप नहीं है । डीएनए पॉलीमरेज की अक्षमता के साथ-साथ टेलोमेरेज की कमी के साथ डीएनए के पश्चगामी भूग्रस्त का विस्तार करने के लिए कोशिकीय विभाजन के हर दौर के बाद टेमराज का उत्तरोत्तर छोटा हो जाता है । इन घटनाओं सबसे दैहिक कोशिकाओं में telomere छोटा करने के लिए नेतृत्व जब तक वे एक गंभीर रूप से छोटा लंबाई तक पहुँचने, जिससे कोशिकाओं रेचक जीर्णता के एक राज्य में प्रवेश. बार एक सेल विभाजित कर सकते है की अधिकतम संख्या अपनी telomere लंबाई से तय है और जारी सेल डिवीजन के लिए इस ब्लॉक के लिए oncogenesis7के लिए प्रगति को रोकने के लिए सोचा है । कैंसर की कोशिकाओं को telomere प्रेरित replicative जीर्णता पर काबू पाने के लिए और telomere का उपयोग करने के लिए उनके telomere बनाए रखने के लिए जारी रखने में सक्षम हैं । कैंसर का लगभग ९०% टेलोमिरेज सक्रिय है, टेलोमिरेज गंभीर रूप से महत्वपूर्ण गतिविधि बनाने के दोनों में जांच और उपचार ।

1990 के दशक में जाल परख के विकास टेलोमिरेज एंजाइम के आवश्यक घटकों की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कोशिकाओं और ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला में टेलोमिरेज के मापन के लिए, दोनों सामांय और कैंसर । मूल जेल आधारित पीसीआर परख रेडियोसक्रिय रूप से डीएनए substrates लेबल के लिए टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने का इस्तेमाल किया । २००६ में, परख एक nonradioactive रूप में अनुकूलित किया गया fluorescently का उपयोग कर8,9substrates लेबल । Fluorescently लेबल substrates का उपयोग करके, उपयोगकर्ताओं को यह सही उत्तेजना तरंगदैर्ध्य को उजागर द्वारा एक जेल पर बैंड के रूप में टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों कल्पना करने में सक्षम थे । जाल परख और इसके लिए कच्चे तेल की सेल lysates में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने की क्षमता की संवेदनशीलता इस परख टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि बना दिया है । हालांकि, जाल परख की सीमाएं हैं । परख जेल आधारित है, यह कठिन प्रदर्शन करने के लिए उदार उच्च throughput अध्ययन करने के लिए, और इस प्रकार, उचित सांख्यिकीय विश्लेषण शायद ही कभी हासिल की है । इसके अलावा, जेल आधारित परख के लिए मज़बूती से नमूनों के बीच टेलोमिरेज गतिविधि में कम दोहरा मतभेदों से पता लगाने की अक्षमता की वजह से मुश्किल है । इन दो सीमाओं पर काबू पाने एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है assays है जैसे जाल रोगी नमूनों या दवा डिजाइन अध्ययन में टेलोमिरेज गतिविधि का पता लगाने के लिए नैदानिक या उद्योग सेटिंग्स में ले जाने के लिए ।

डिजिटल पीसीआर को प्रारंभ में १९९९ में पीसीआर के घातीय और एनालॉग प्रकृति को एक रैखिक और डिजिटल परख10में परिवर्तित करने के लिए एक साधन के रूप में विकसित किया गया था । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) मूल डिजिटल पीसीआर प्रणाली के सबसे हाल ही में नवाचार है । छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर उंनत microfluidics और तेल में पानी पायस रसायन के आगमन के साथ मज़बूती से स्थिर और समान रूप से आकार बूंदों उत्पंन करने के लिए आया था । जेल आधारित और यहां तक कि मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) के विपरीत, ddPCR इनपुट सामग्री का पूर्ण प्रमात्रीकरण उत्पंन करता है । DdPCR के लिए कुंजी ~ २०,००० बूंदों में विभाजन नमूनों द्वारा व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं की पीढ़ी है । अंत बिंदु पीसीआर के बाद, छोटी बूंद पाठक एक प्रवाह-cytometer की तरह फैशन, गिनती, नौकरशाही का आकार घटाने में प्रत्येक छोटी बूंद को स्कैन, और उपस्थिति या प्रत्येक व्यक्ति छोटी बूंद में प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति रिकॉर्डिंग (यानी, अनुपस्थिति या प्रत्येक छोटी बूंद में पीसीआर amplicons की उपस्थिति) । फिर, पॉसन के वितरण का उपयोग करके, इनपुट अणुओं को बूंदों की कुल संख्या के लिए सकारात्मक बूंदों के अनुपात के आधार पर अनुमान लगाया जाता है । यह संख्या प्रत्येक पीसीआर में इनपुट अणुओं की संख्या का अनुमान दर्शाती है । इसके अलावा, ddpcr प्रदर्शन किया है और एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट जो उपयोगकर्ता कई नमूनों को चलाने के लिए, साथ ही जैविक और तकनीकी उचित सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रतिकृति प्रदर्शन की अनुमति देता है पर विश्लेषण । परिणामस्वरूप, हमने डीडीपीसीआर की शक्तिशाली मात्रा और मॉडरेट थ्रूपुट प्रकृति को ट्रैप परख के साथ जोड़ दिया है ताकि डीडीट्रैप आमापन11को विकसित किया जा सके । इस परख के लिए उपयोगकर्ताओं के अध्ययन के लिए डिज़ाइन किया गया है और दृढ़ता से जैविक नमूनों11,12से पूर्ण टेलोमिरेज गतिविधि मात्रा ठहराना । Ddtrap की संवेदनशीलता सीमित और कीमती नमूनों से टेलोमिरेज गतिविधि की मात्रा, एकल कोशिका माप सहित की अनुमति देता है । इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं को भी टेलोमिरेज जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन कर सकते है और/या दवाओं के पूर्ण प्रमात्रीकरण से कम दोहरा परिवर्तन (~ ५०% मतभेद) । DdTRAP आधुनिक प्रयोगशाला प्रयोगों और नैदानिक सेटिंग्स की डिजिटल और उच्च थ्रूपुट प्रकृति में जाल परख के प्राकृतिक विकास है ।

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Protocol

1. बफर तैयारी और भंडारण

  1. 1x स्टॉक RNase-/Dnase-free एनपी-४० lysis बफर के ५० मिलीलीटर तैयार करें (10 मिमी Tris-एचसीएल [पीएच ८.०], 1 मिमी MgCl2, 1 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 1% [vol/vol] NP-४०, 10% [vol/०.१ १५० बेन्ज़ेनेसल्फोनिल फ्लोराइड हाइड्रोक्लोराइड (AEBSF)) । भविष्य में उपयोग के लिए इस बफ़र को-20 ° c पर aliquoted और संग्रहित किया जा सकता है । सेल का एक इष्टतम lysis प्राप्त करने के क्रम में फ्रीज/
  2. 10x स्टॉक RNase-/Dnase-free ट्रैप एक्सटेंशन बफर (२०० mM Tris-HCl [पीएच ८.०] के ५० मिलीलीटर तैयार करें, 15 मिमी MgCl2, ६३० मिमी kcl, ०.५% [vol/vol] बीच 20, और 10 मिमी एथिलीन glycol-बीआईएस (β-aminoethyl ईथर)-N, N, n ′, '-tetraacetic एसिड (egta)) । यह बफर 1 मिलीलीटर aliquots में aliquoted किया जा सकता है और भविष्य में उपयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।

2. कोशिका अपघटन

  1. कोशिकाओं की तैयारी
    1. NP-४० lysis बफर के एक जमे हुए aliquot पिघलना । एक बार thawed, बर्फ पर lysis बफर जगह है । ४० lysis बफर के लिए ०.२ मिमी की अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए, phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड (pmsf प्रोटीज अवरोध करनेवाला) जोड़ें ।
      नोट: यह तुरंत पहले किया जाना चाहिए कोशिकाओं lysing ।
    2. एकत्र सेल छर्रों से किसी भी अतिरिक्त तरल निकालें एक सूखी सेल गोली सुनिश्चित करने के लिए । ध्यान दें कि सेल छर्रों, चाहे हौसले से एकत्र या पहले जमे हुए (-८० डिग्री सेल्सियस या फ्लैश तरल N2में जमे हुए), इन समाधानों के रूप में नीचे की प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते है पिछले केंद्राधरण से किसी भी बचे हुए समाधान नहीं होना चाहिए ।
    3. विकसित, इकट्ठा, और दोनों telomerase सकारात्मक और telomerase नकारात्मक सेल लाइंस (बी. जे. फाइब्रोब्लास्ट, शिशु मृत्यु दर-९० या U2OS) स्थिर करने के लिए उंहें सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए । का प्रयोग करें नई नियंत्रण हर बार परख परख reproducibility सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है lysates ।
      नोट: यह सलाह दी जाती है कि telomerase-नकारात्मक कोशिकाओं की एक बड़ी संस्कृति हो गया है और aliquoted करने के लिए किसी भी ऊतक-संस्कृति से संबंधित कलाकृतियों कि सेल लाइनों के दीर्घकालिक संस्कृति के दौरान पेश किया जा सकता है को दूर करने के लिए प्रतिलिपि reproducible परिणाम सुनिश्चित करने में मदद नकारात्मक नियंत्रण नमूना ।
    4. सेल छर्रों को बर्फ पर रखें । यदि कोशिकाओं को जमे हुए थे, उंहें बर्फ पर संक्षेप में गल करने के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: ddTRAP के लिए विशिष्ट कक्ष पैलेट आकार ५००,००० और १,०००,००० कक्षों के बीच हैं । छोटे सेल छर्रों भी यदि आवश्यक हो तो इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन सेल नंबर होना चाहिए/ DdTRAP भी प्रोटीन एक बीसीए प्रोटीन परख का उपयोग कर इनपुट के आधार पर किया जा सकता है (आमतौर पर इनपुट 1 μg है) ।
  2. कोशिकाओं के lysing
    1. Lyse एनपी में कोशिकाओं-४० lysis बफर । २५,००० कोशिका की तुल्यता को बनाए रखें । उदाहरण के लिए, lyse एक गोली (जिसमें १,०००,००० कोशिकाओं) एनपी के ४० μL-४० lysis बफर । धीरे से lysate ऊपर और नीचे पिपेट क्रम में खोलने के लिए कोशिकाओं को तोड़ने । बुलबुले बनाने से बचने की कोशिश करें ।
    2. कोशिकाओं को बर्फ पर lyse के लिए अनुमति दें 30 मिनट के लिए धीरे से बनाने के लिए सेल मलबे के समूहों को रोकने के lysate भंवर सुनिश्चित करें । यह हर 10 मिनट किया जा सकता है और lysate एक homogenized मिश्रण रखने का मतलब है ।
    3. NP-४० lysis बफर में कोशिका lysate (२५,००० कोशिकाओं/μL) 1:20, नए सेल तुल्यता १,२५० कोशिकाओं/ उदाहरण के लिए, lysis बफ़र के ९५ μL में सेल lysate के 5 μL तनु ।

3. telomerase एक्सटेंशन रिएक्शन

  1. टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति प्रतिक्रिया) के लिए एक मास्टर मिक्स (तालिका 1) तैयार करते हैं ।
    नोट: यह सेल lysis के दौरान विस्तार रिएक्शन मास्टर मिक्स तैयार करने और बर्फ पर यह स्टोर करने के लिए सबसे अच्छा है ।
    1. Pipet ४८ μL एक्सटेंशन मास्टर प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में मिक्स ।
    2. विस्तार प्रतिक्रिया करने के लिए पतला (१,२५० कोशिकाओं/μL) lysate के 2 μL जोड़ें । कुल आयतन अब ५० कोशिकाओं/μL की अंतिम कोशिका तुल्यता के साथ ५०-l होना चाहिए ।
  2. टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया (तालिका 2) निष्पादित करें ।
  3. टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 – 5 दिनों के लिए स्टोर करें; हालांकि, यह पहले 24 घंटे के भीतर विस्तार उत्पादों का उपयोग करने के लिए इष्टतम है ।

4. छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर सेटअप

  1. DdTRAP (प्रति प्रतिक्रिया) के लिए एक मास्टर मिक्स (तालिका 3) तैयार करते हैं ।
    नोट: एक बार अभिकर्मक कमरे के तापमान पर हैं, उंहें या बर्फ पर मास्टर मिश्रण जगह नहीं है । बर्फ पर मिश्रण रखने चिपचिपापन बढ़ जाती है और गरीब छोटी बूंद गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । डीपीसीआर सुपरमिक्स में डीएनए पॉलीमेरेज एक हॉट स्टार्ट है और इसे कमरे के तापमान पर स्थिर होना चाहिए । DdPCR सुपरमिक्स को-20 डिग्री सेल्सियस से एक प्रारंभिक गलन के बाद 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है ।
    1. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब में ddPCR मास्टर के pipet १९.८ μL मिक्स ।
    2. प्रत्येक ट्यूब के लिए विस्तार प्रतिक्रिया के २.२ μL जोड़ें । ध्यान दें कि कुल मात्रा अब 22 μL होना चाहिए ।
      नोट: एक ddTRAP के लिए आवश्यक नमूना की कुल मात्रा 20 μL (१०० कोशिकाओं की कोशिका तुल्यता) है । अतिरिक्त मात्रा पिपेट त्रुटि या नमूना हानि के लिए एक एहतियात है ।
  2. छोटी बूंद पीढ़ी कारतूस सेट ।
    नोट: कारतूस तीन कुओं के विभिंन स्तंभों कि लेबल रहे है शामिल हैं ।
    1. लोड प्रतिक्रिया के 20 μL कदम 4.1.2 के अनुसार नमूना अच्छी तरह से (मध्य कूप) में कारतूस में तैयार । नमूने pipetting जब बुलबुले से बचें.
      नोट: यदि बुलबुले हैं, धीरे कारतूस के पक्ष पर टैप इतना है कि इन बुलबुले समाधान के शीर्ष करने के लिए आते हैं ।
    2. तेल अच्छी तरह से (अच्छी तरह से छोड़ दिया) में छोटी बूंद पीढ़ी के तेल की ७० μL लोड ।
      नोट: संदूषण से बचने के लिए, कड़ाई से पिपेट और ddpcr छोटी बूंद पीढ़ी कदम के लिए सुझावों का एक अलग सेट का उपयोग करें । कारतूस लोड करने का क्रम महत्वपूर्ण है । नमूने तेल लोड करने से पहले लोड किया जाना चाहिए के रूप में भारी है और microfluidic कक्षों को भरने और गरीब छोटी बूंद गठन के लिए नेतृत्व करेंगे । जिन नमूनों को चलाया जा सकता है उनकी न्यूनतम संख्या आठ है । कारतूस के सभी कुओं के नमूने के साथ किसी भी खाली अच्छी तरह से बिंदकी जनरेटर से छोटी बूंद पीढ़ी में एक पड़ाव का नेतृत्व करेंगे के रूप में लोड किया जाना चाहिए । यदि पर्याप्त नमूनों को एक कारतूस के भीतर सभी आठ कुओं लोड उपलब्ध नहीं हैं, ddTRAP मास्टर मिक्स के 20 μL (कदम ४.१) शेष कारतूस में लोड किया जा सकता है ।
    3. कारतूस के सिरों को tethering द्वारा जगह में गैस्केट सुरक्षित ।
      नोट: कमी या गैस्केट की अनुचित स्थान पैदा बूंदों से जनरेटर को रोकने जाएगा ।
    4. जगह भरी हुई है और छोटी बूंद जनरेटर में इकट्ठे कारतूस ।
      नोट: कारतूस जनरेटर में एक चुंबक है, जो उपयोगकर्ता जब कारतूस ठीक से रखा जाता है सूचित करेंगे द्वारा मांयता प्राप्त है ।
  3. कारतूस निकालें एक बार बूंदों उत्पन्न कर रहे हैं और चक्र पूरा हो गया है (~ 60 – 90 एस).
    1. धीरे से कारतूस से गैस्केट हटा दें । एक ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट में एक मल्टीचैनल pipette का उपयोग कर, नव जनित बूंदों (सही अच्छी तरह से) pipet ।
      नोट: नई जनरेट की गई छोटी बूंद पायस के लिए अनुमानित मात्रा 40 – 43 μL होनी चाहिए ।
    2. हीट एल्यूमीनियम पंनी पीसीआर प्लेट जवानों के साथ थाली सील एक बार सभी नमूनों ९६-कूप प्लेट में लोड कर रहे है क्रम में पीसीआर कदम के दौरान वाष्पीकरण को रोकने के लिए ।
  4. Thermocycler में ९६-कूप प्लेट लोड और निंनलिखित पीसीआर प्रतिक्रिया (तालिका 4) प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: प्रतिक्रियाओं को ठीक से गर्म करने के लिए तापमान कदम के बीच सभी रैंप दर २.५ ° c/s करने के लिए सेट किया जाना चाहिए ।

5. टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों की पहचान

  1. लोड ९६-छोटी बूंद पाठक में अच्छी तरह से थाली ।
    नोट: प्लेट ठीक से उन्मुख करने के लिए सुनिश्चित करें ताकि A1 नमूना धारक के साथ मेल खाता है.
    1. छोटी बूंद रीडर के साथ जुड़े सॉफ्टवेयर खोलें । पहली अच्छी तरह से A1 का नमूना खोलने के लिए डबल क्लिक करें/
    2. प्रयोग पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से एबीएस चुनें.
      नोट: प्रयोग परख के प्रकार को परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया जा (यानी, निरपेक्ष मात्रा या जीन की प्रतिलिपि संख्या परख) । ABS निरपेक्ष परिमाणीकरण के लिए खड़ा है ।
    3. यह सुनिश्चित करने के लिए कि सही पता लगाने की विधि पाठक द्वारा नियोजित है, QX200 ddPCR Evagreen सुपरमिक्स का चयन करें । हाइलाइट किए गए कुओं के सभी के लिए उपयोगकर्ता परिभाषित सेटिंग्स को बचाने के लिए अच्छी तरह से संपादक स्क्रीन के निचले दाहिने हाथ की ओर में लागू क्लिक करें.
      नोट: Supermix पीसीआर मिश्रण और पता लगाने रसायन शास्त्र है कि पाठक द्वारा पढ़ा जाएगा के प्रकार को परिभाषित करता है ।
    4. आदेश में नमूना परिभाषित करने के लिए सॉफ्टवेयर के अच्छी तरह से संपादक स्क्रीन में लक्ष्य पर क्लिक करें ।
    5. लक्ष्य ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करके और या तो अज्ञात, संदर्भ, या एनटीसी (कोई टेंपलेट नियंत्रण) का चयन करके नमूने के प्रकार निर्धारित करें ।
      नोट: अज्ञात एक प्रयोगात्मक नमूना का उल्लेख होगा, संदर्भ ज्ञात टेलोमिरेज गतिविधि का एक नियंत्रण नमूना हो सकता है, और एक एनटीसी संदूषण के मामले में परख वैधता के निर्धारण के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण है और पृष्ठभूमि संकेत ।
    6. नमूना नाम अनुभाग में सभी नमूनों को लेबल और लागू क्लिक करें सुनिश्चित करने के लिए प्रकाश डाला कुओं उचित रूप से संपादित कर रहे हैं.
  2. थाली को चलाने/पढ़ने के लिए चलाएं क्लिक करें । ओरिएंटेशन के बारे में मशीन को सूचित करने के लिए संकेत दिए जाने पर चलाएँ विकल्प स्क्रीन में या तो स्तंभों या पंक्तियों का चयन करें थाली में पढ़ना चाहिए ।

6. डेटा विश्लेषण

  1. व्यक्तिगत कुओं पर क्लिक करके प्रत्येक नमूने के लिए स्वीकृत बूंदों की संख्या निर्धारित करते हैं । नमूना डेटा देखने और विश्लेषित करने के लिए व्यक्तिगत कुओं या स्तंभ/
    नोट: एक विशेष नमूने के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ने के लिए या नहीं पर सबसे महत्वपूर्ण मापदंड "स्वीकृत बूंदों" की संख्या है । DdTRAP के लिए, १०,००० या अधिक स्वीकृत बूंदों के साथ नमूने आगे विश्लेषण के लिए मांय हैं । एक. csv टेबल,. jpg छवियों, histograms, आदि सहित कई प्रारूपों में उपयोगकर्ता के लिए डेटा प्रदान किया जा सकता है । Ddpcr11,13सहित ddpcr डेटा के गहन विश्लेषण के लिए कई संसाधन उपलब्ध हैं । ये संसाधन ddtrap डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक मार्गदर्शिका प्रदान करते हैं,11,13 और विश्लेषण के लिए नमूनों को चुनने के लिए थ्रेशोल्ड का चयन करने से11, 13, झूठी सकारात्मक और13नकारात्मक की पहचान, और सामांय समस्या निवारण13।
  2. नमूना प्रतिकृति और एनटीसी नमूनों का प्रतिनिधित्व कुओं को हाइलाइट करें । या तो एनटीसी या नकारात्मक नियंत्रण लाइनों, जैसे मुखमैथुन कोशिकाओं की तुलना में नमूनों का विश्लेषण (चरण 2.1.2 में ऊपर सूचीबद्ध के रूप में).
    1. मैंयुअल रूप से स्क्रीन के नीचे बाईं ओर थ्रेसहोल्ड सेट करने के लिए चिह्न पर क्लिक करके नमूनों के लिए थ्रेशोल्ड सेट करें । एक समय में प्रत्येक व्यक्ति के लिए अच्छी तरह से या एकाधिक कुओं के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करें (अनुशंसित) ।
      नोट: यदि पृष्ठभूमि एनटीसी में पाया जाता है, यह अंय नमूनों के सभी से घटाया जा सकता है ' के लिए मानक ' संकेत और यह सुनिश्चित करें कि केवल सच सकारात्मक संकेत का विश्लेषण किया है । एनटीसी मान आमतौर पर NP-४० lysis बफ़र सिस्टम के लिए 0.2 – 1 अणु/μL श्रेणी में हैं । अन्य बफ़र सिस्टम और घटक (उदाहरण के लिए, CHAPS बफ़र्स) का परीक्षण किया जा करने के लिए की आवश्यकता होगी ।

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Representative Results

Ddtrap का उपयोग करते हुए, टेलोमिरेज गतिविधि एक सेल निंनलिखित कोशिका लाइनों से मिलकर पैनल में मापा गया था (चित्रा 1): nonsmall सेल फेफड़ों के कैंसर (H2882, H1299, Calu6, H920, A549, और H2887), छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर (H82 और SHP77), और टेलोमिरेज-नकारात्मक फाइब्रोब्लास्ट (बीजे) । १,०००,००० सेल छर्रों एनपी में एक-४० बफर थे, और टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रियाओं जैविक triplicates में प्रदर्शन किया गया । एक आम और अत्यधिक की सिफारिश की नकारात्मक नियंत्रण "एनटीसी", नहीं, टेंपलेट नियंत्रण है । इस नमूने को जोड़ने के द्वारा उत्पन्न होता है NP-४० lysis बफर (2 μl) टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया करने के लिए और एक समान तरीके से विस्तार उत्पादों के साथ आगे बढ़ने के अन्य नमूनों को वास्तविक सेल lysate युक्त. यह नमूना उपयोगकर्ता पृष्ठभूमि संकेत को घटाना करने के लिए, यदि कोई हो, टेलोमिरेज गतिविधि बेहतर मात्रा करने के लिए अनुमति देता है । हालांकि इस आंकड़े में नहीं दिखाया गया है, यह भी संभव है गर्मी निष्क्रिय करें सके ९५ पर 5 मिनट के लिए एक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया से पहले lysate । यह नकारात्मक नियंत्रण पसंद किया जाता है यदि सेल/नमूना बहुतायत कोई समस्या नहीं है ।

बिंदकी पायस में हर एक छोटी बूंद की प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा, बिंदुक पाठक पॉसन वितरण (चित्र 1a) का उपयोग कर इनपुट अणुओं (अणुओं/microliter) की एकाग्रता का अनुमान लगाने में सक्षम था । Ddtrap के मामले में, इन इनपुट अणुओं टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों थे । Ddtrap परख के तंत्र के रूप में इस प्रकार था: टेलोमिरेज TS सब्सट्रेट विस्तारित । इन विस्तारित सबस्ट्रेट्स ने डीडीपीसीआर में पीसीआर टेंपलेटों के रूप में काम किया । पीसीआर-प्रवर्धित substrates का परिमाणीकरण एक दिए गए सेल लाइन के भीतर टेलोमिरेज एंजाइमी गतिविधि का प्रतिनिधित्व प्रदान की है । हर छोटी बूंद के रूप में चित्र 1aमें दिखाया साजिश रची थी । DdTRAP के लिए थ्रेशोल्ड सेट करना व्यक्तिपरक हो सकता है; हालांकि, उचित नकारात्मक नियंत्रण के साथ, उपयोगकर्ता आसानी से ऐसा कर सकते हैं । चित्र 1aमें दिखाए गए उदाहरण में, SHP77, H2887, और एनटीसी के लिए सभी तीन जैविक प्रतिकृति के लिए एक थ्रेशोल्ड सेट किया गया था । सकारात्मक बूंदों के आसपास एक प्रतिदीप्ति तीव्रता था ६,००० प्रतिदीप्ति आयाम (एफए) और शीर्ष पर एक स्पष्ट आबादी का गठन और १,१०० एफए के आसपास नकारात्मक बूंदों से अलग. इसलिए, थ्रेशोल्ड इस experiment में ~ २,००० FA पर सेट किया जा सकता है ।

एक बार डेटा एकत्र और निर्यात किया गया था, यह सभी नमूनों के बीच प्रति सेल समकक्ष कुल टेलोमिरेज विस्तार उत्पादों की गणना करने के लिए संभव था (चित्र 1b). हर अच्छी तरह से संकेत एक निरपेक्ष एकाग्रता (अणुओं/ 20 द्वारा एकाग्रता (नमूना ddPCR कारतूस में इनपुट की मात्रा) गुणा करके, उपयोगकर्ता अणुओं की कुल संख्या प्राप्त कर सकते हैं । यह संख्या तब ज्ञात कक्ष समकक्ष (ddTRAP के हमारे प्रदर्शन में, हम १०० कक्षों का उपयोग) द्वारा विभाजित किया जा सकता है । यह अंतिम मान y-अक्ष पर दर्शाए अनुसार टेलोमेरेज एक्सटेंशन उत्पादों की प्रति कक्ष समकक्ष इकाइयों में है ।

Figure 1
चित्रा 1: एक फेफड़ों के कैंसर के पैनल में Telomerase गतिविधि । (क) SHP77, H2887 और एनटीसी के लिए छोटी बूंद फ्लोरेसेंस तीव्रता (प्रतिदीप्ति आयाम) के 1d आयाम । SHP77, H2887 और एनटीसी के लिए कूपों का चयन किया गया था और २,००० एफए पर मैनुअल सीमा निर्धारित की गई थी । (ख) टेलीमेरेज गतिविधि का अनुमान न्यूक्लिक अम्लों की मापी गई सांद्रता से लगाया गया था और यह पता लगाया गया था कि फेफड़ों के कैंसर की रेखाओं में टेलोमरेज क्रियाकलाप की तुलना करने के लिए पी सी आर को निम्नलिखित पाया गया है । एफए = फ्लोरोसेंस आयाम इकाइयों । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

टेलोमिरेज गतिविधि की माप सहित अनुसंधान विषयों के एक बहुतायत के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन तक ही सीमित नहीं, कैंसर, टेलोमिरेज जीवविज्ञान, उंर बढ़ने, पुनर्योजी चिकित्सा, और संरचना आधारित दवा डिजाइन । Telomerase RNPs कम प्रचुर मात्रा में हैं, यहां तक कि कैंसर की कोशिकाओं में, इस एंजाइम चुनौतीपूर्ण का पता लगाने और अध्ययन कर रही है । इस अखबार में, हम नए विकसित ddtrap परख के लिए कदम दर कदम प्रक्रियाओं के लिए दृढ़ता से कोशिकाओं में टेलोमिरेज गतिविधि मात्रा बताना बताया । Ddpcr के साथ पारंपरिक टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया के संयोजन से, हम फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में टेलोमिरेज गतिविधि (टेलोमिरेज-विस्तारित उत्पादों) मात्रात्मक का पता लगाने में सक्षम थे ।

DdTRAP परख जाल परख के रूप में एक ही सिद्धांत पर निर्भर करता है । सेल lysates एक nonionic डिटर्जेंट (NP-४०) lysis बफर में lysing कोशिकाओं द्वारा प्राप्त कर रहे है एंजाइम गतिविधि को बनाए रखने और फिर "टीएस" सब्सट्रेट के एक टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया/ DdTRAP की नवीनता पीसीआर से पहले बूंदों के गठन पर निर्भर करता है । बूंदों में नमूने के विभाजन परख सेल प्रति टेलोमिरेज गतिविधि का पूर्ण मात्रा में प्राप्त करने के लिए अनुमति देता है ।

Telomerase गतिविधि फेफड़ों के कैंसर सेल लाइनों में मापा गया था, ddTRAP का उपयोग कर । जेल आधारित जाल परख की प्रमुख सीमाओं में से एक है कि एक समय में संसाधित किया जा सकता नमूनों की संख्या है । सबसे जेल कंघी केवल 20 कुओं को समायोजित कर सकते है/ इसके विपरीत, ddTRAP एक समय में ९६ नमूनों को चला सकते हैं, काफी नमूनों की संख्या बढ़ रही है कि एक ही बार में संसाधित किया जा सकता है । हम आठ सेल लाइनों में टेलोमिरेज गतिविधि assayed । सबसे महत्वपूर्ण बात, हम 24 विस्तार प्रतिक्रियाओं की कुल के लिए जैविक triplicates में प्रत्येक टेलोमिरेज विस्तार प्रतिक्रिया भाग गया । हम तो प्रत्येक एक्सटेंशन प्रतिक्रिया चलाने में सक्षम थे के रूप में तीन तकनीकी पीसीआर के लिए प्रतिकृति ddPCR प्लेट पर ७२ नमूनों की कुल के लिए । इसके अलावा, ddTRAP परख एक interday CV (भिंनता के गुणांक) १०० सेल समकक्ष के लिए ५.१% और १०० सेल समकक्ष के लिए ८.६१% की एक intraday CV के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्रदान करता है । Interday और intraday का प्रतिनिधित्व करते है जैविक दो अलग प्लेटों या एक ही थाली पर चलाने के लिए, क्रमशः, HeLa सेल पर11lysates । यदि ७२ नमूनों पारंपरिक जाल या किसी अंय जेल आधारित परख में संसाधित किया गया, यह बहुत अधिक हाथ समय पर की आवश्यकता होगी । यह अभिकर्मकों की उच्च लागत की ओर जाता है, और अधिक मूल्यवान समय कर्मचारियों से जरूरत/छात्रों/प्रशिक्षुओं, एक उच्च जेल से जेल परिवर्तनशीलता, और उपयोगकर्ताओं और प्रयोगशालाओं के बीच reproducibility की कमी है । मज़बूती से और आसानी से ddtrap में प्रतिकृति चलाने की क्षमता जेल पर एक नाटकीय सुधार आधारित assays है और कई नमूनों की अनुमति देता है कुशलतापूर्वक संसाधित है, जो डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण में एड्स ।

अंत में, ddtrap में सामांय में नमूनों के बीच कम परिवर्तनशीलता और आवश्यक प्रतिकृति प्रदर्शन करने की संभावना प्रयोक्ताओं के नमूनों के बीच कम दोहरा परिवर्तन का निरीक्षण करने की अनुमति देता है । सबसे जेल आधारित assays हैं की प्रमुख सीमा उचित मात्रा की कमी है । यहां, ddTRAP का उपयोग कर, हम विभिंन फेफड़ों के कैंसर लाइनों के बीच में सूक्ष्म अंतर का पता लगा सकते हैं । सूक्ष्म मतभेद महत्वपूर्ण हो सकता है जब यह टेलोमिरेज गतिविधि लक्ष्यीकरण दवाओं की तुलना करने के लिए आता है और तय है कि उच्च throughput स्क्रीन से छोटे अणु यौगिकों के साथ आगे बढ़ने के लिए या नहीं ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखकों को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) (NCI-R00-CA197672-01A1) से धन स्रोतों को स्वीकार करना चाहते हैं । छोटे सेल फेफड़ों के कैंसर लाइनों (SHP77 और H82) Drs से एक उदार उपहार थे । जॉन Minna और आदि Gazdar यूटी पश्चिमी चिकित्सा केंद्र से ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 M Tris-HCl pH 8.0 Ambion AM9855G RNAse/DNAse free
1 M MgCl2 Ambion AM9530G RnAse/DNAse free
0.5 M EDTA pH 8.0 Ambion AM9261 RNAse/DNAse free
Surfact- Amps NP-40 Thermo Scientific 28324
100% Ultrapure Glycerol Invitrogen 15514011 RNAse/DNAse free
phenylmethylsulfonyl fluoride Thermo Scientific 36978 Powder
2-Mercaptoethanol SIGMA-ALDRICH 516732
Nuclease Free H20 Ambion AM9932 RNAse/DNAse free
2.5 mM dNTP mix Thermo Scientific R72501 2.5 mM of each dATP, dCTP, dGTP and dTTP
2 M KCl Ambion AM9640G RNAse/DNAse free
100% Tween-20 Fisher 9005-64-5
0.5 M EGTA pH 8.0 Fisher 50-255-956 RNAse/DNAse free
Telomerase Substrate (TS) Primer Integrated DNA Technology (IDT) Custom Primer (HPLC Purified) 5'- AATCCGTCGAGCAGAGTT-3'
ACX (Revers) Primer Integrated DNA Technology (IDT) Custom Primer (HPLC Purified) 5'- GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC -3'
Thin walled (250 ul) PCR grade tubes USA Scientific 1402-2900 strips, plates, tubes etc.
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio Rad 1864034
Twin-Tec 96 Well Plate Fisher Eppendorf 951020362
Piercable foil heat seal Bio Rad 1814040
Droplet generator cartidges (DG8) Bio Rad 1863008
Droplet generator oil Bio Rad 1863005
Droplet generator gasket Bio Rad 1863009
96-well Thermocycler T100 Bio Rad 1861096
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000
QX200 Droplet Reader and Quantasoft Software Bio Rad 1864001 and 1864003
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004
Nuclease Free Filtered Pipette Tips Thermo Scientific 10 ul, 20 ul , 200 ul and 1000 ul

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References

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कैंसर अनुसंधान मुद्दा १४७ telomerase जाल परख छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर कैंसर एंजाइमी गतिविधि का पता लगाने उंर बढ़ने मात्रात्मक जीवविज्ञान
छोटी बूंद डिजिटल ट्रैप (ddTRAP): छोटी बूंद डिजिटल Polymerase चेन रिएक्शन करने के लिए Telomere दोहराने प्रवर्धन प्रोटोकॉल के अनुकूलन
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Sayed, M. E., Slusher, A. L.,… More

Sayed, M. E., Slusher, A. L., Ludlow, A. T. Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction. J. Vis. Exp. (147), e59550, doi:10.3791/59550 (2019).

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