הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול החלים בקלות כדי להעריך את יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות, קבוצה של חלקיקים המתרחשים באופן טבעי המיוצר על ידי תאים. שלפוחיות הם טעונים עם glucuronidase כאנזים מודל מאוחסן בתנאים שונים. לאחר האחסון, הפרמטרים הפיזיקליים שלהם והפעילות של האנזים שעברו האנקפסולציה מוערכים.
Abstract
שלפוחיות שלפוחית (EVs) הם מטרות מבטיחות במחקר הנוכחי, לשמש סמים, סוחרי סמים, ו בסמנים. עבור הפיתוח הקליני שלהם, לא רק פעילות התרופות שלהם חשוב, אלא גם הייצור שלהם צריך להיות מוערך. בהקשר זה, המחקר מתמקד בבידוד של EVs, האפיון שלהם, האחסון שלהם. כתב היד הנוכחי שואפת לספק הליך נתיישב להערכת ההשפעה של תנאי אחסון שונים ב-EVs, ללא מניפולציה גנטית או assays פונקציונלי ספציפי. זה מאפשר במהירות לקבל רושם ראשוני של היציבות של EVs תחת מצב אחסון נתון, ו EVs נגזר ממקורות תאים שונים ניתן להשוות בקלות. מידת היציבות מתבססת על הפרמטרים הפיזיקליים של EVs (גודל, ריכוז חלקיקים ומורפולוגיה) ושימור פעילות המטען שלהם. האחרון הוא העריך על ידי saponin בתיווך עטיפת האנזים ביתא-glucuronidase לתוך EVs. Glucuronidase משמשת כפונדקאית ומאפשרת כימות קלה דרך המחשוף של מולקולת כתב פלורסנט. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות כלי עבור חוקרים בחיפוש אחר תנאי אחסון באופן אופטימלי לשמור על מאפייני EV כדי לקדם מחקר EV לקראת יישום קליני.
Introduction
EVs הם חלקיקים מאוגד קרום המיוצר על ידי כל סוגי התא כמעט. עבור תאים ממיונקים, EVs ניתן לחולק לשתי קבוצות עיקריות עם שבילים הפקה ברורים1,2. שלפוחיות ממברנה, עם טווח גודל של בערך 100-1000 ננומטר, מיוצרים על ידי הנצה ישירה מקרום התא. אקסוזומים, בגודל 30-200 ננומטר, נגזרות מגופים רב שנוצרו על ידי הבנה פנימה לתוך אנזומים כי לאחר מכן הפתיל עם קרום התא כדי לשחרר האקסוזומים מרובים בבת אחת. הפונקציה העיקרית של שלפוחיות אלה היא העברת מידע בין תאים3. למטרה זו, מטענים כגון RNA, DNA, ו חלבונים ממוינים באופן פעיל לתוכם. EVs יכול להעביר מגוון של אפקטים על המטרות שלהם, עם השלכות על מצב בריאות ומחלות הן. בצד אחד, הם מתווכים אפקטים חיוביים כגון התחדשות רקמות, אנטיגן מצגת, או תופעות לאנטיביוטיקה, מה שהופך אותם מטרות מוצלחת עבור הפיתוח שלהם כמו therapeutics4,5. בצד השני, EVs יכול לקדם את הגידול vascularization6, לגרום לתופעות העובר בתגובות מתח7, ו עשוי לשחק תפקיד מחלות אוטואימוניות8 ומחלות דלקתיות9. לכן, הם עשויים להיות מרכיב מפתח להבנה טובה יותר של השפעות פתולוגיים רבות. עם זאת, הנוכחות של EVs שונה במחלות סעפת, כגון סרטן10,11,12 והפרעות לב וכלי דם13, ואת הנגישות הקל שלהם בדם ובשתן עושה אותם אידיאלי סמנים. בסופו של דבר, ביולוגית טובה14 שלהם יכולת מיקוד שלהם להפוך EVs מעניין גם לאספקת סמים15. בכתב יד זה אנו מתארים פרוטוקול להערכת יציבות האחסון של EVs שנגזר מתאי מיונקים, מאפיין חשוב שעדיין נחקר מעט.
עבור הפיתוח הקליני של EVs, יש עדיין מכשולים רבים להתגבר על16, כולל הערכה של ההשפעות הטיפוליות שלהם, ייצור, טיהור, ואחסון17. בעוד-80 ° c הוא ראה נרחב כמו תקן זהב עבור EV אחסון18, מקפיאים נדרשים יקרים, ושמירה על שרשרת קר הנדרש מייצור למטופל יכול להיות מאתגר. יתר על כן, דיווחים מסוימים מצביעים על כך אחסון ב-80 ° c עדיין לא אופטימלית שומרת EVs ומשרה הפסד ב-EV פונקציונליות19,20. שיטות אחרות, כגון הקפאת ייבוש21,22 או ספריי ייבוש23, הוצעו כחלופות פוטנציאליות אחסון קפוא של EVs.
הדרך האופטימלית של הערכת יציבות אחסון יהיה לבחון את EVs באופן פונקציונלי או על ידי הערכה של סמן מסוים, למשל, פעילות אנטיבקטריאלי שלהם19. זה אפשרי כאשר ההשפעה הרצויה של שלפוחיות ידוע וכאשר קבוצה אחת שונה של EVs היא ללמוד. אם EVs ממקורות תא שונים יש להשוות (למשל, עבור עטיפת התרופה) או אם אין בדיקה תפקודית ידועה, אין עוד אפשרות להעריך שינויים עקב אחסון באופן ישיר.
מצד שני, פשוט להעריך שינויים בפרמטרים הפיזיקליים שלהם, כגון גודל, שחזור חלקיקים, וריכוז חלבונים, לא תמיד לחזות שינויים בפעילות EV, כפי שמוצג בפטנט האחרון20.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול החלים בקלות למדידת יציבות האחסון של EVs על ידי הערכת הפרמטרים הפיזיקליים שלהם בשילוב עם הפעילות של אנזים בטא glucuronidase כימוע כפונדקאית עבור המטען של EVs. טעינת האנזים נעשית על ידי הדגירה סאפונין, שיטה קלה שהוקמה עם EVs ממקורות שונים21,24,25. Saponin צורות נקבוביות זמניות ב קרום EV, אשר מאפשר ספיגת אנזימים לתוך vesicle. כמו אנזימים נוטים לאבד את פעילותם אם נתון לתנאי אחסון שלילי, הם תחליף אידיאלי להערכת שימור של מטענים פונקציונליים של EVs.
הדגמנו כי היישום של פרוטוקול זה כדי EVs נגזר מתאי גזע האדם mesenchymal (MSCs), הטבור האנושי תאים אנדותל (HUVECs), ו אדנוקרצינומה האדם תאים אפיתל (A549) אכן תוצאה הבדלים גדולים יציבות אחסון בין קווי תאים שונים, אשר יש לקחת בחשבון בעת בחירת מקור EV21.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף לחקר יציבותה של EVs תחת תנאי אחסון שונים. עם שילוב של glucuronidase כדורית כבדיקה תפקודית והערכה של הפרמטרים הפיסיוכימיים של EVs, הפרוטוקול מאפשר הערכה ברורה של יציבות האחסון של EVs והשוואה של EVs מתא שונים קווים. SEM ו-TEM כשיטות משלימות מאפשרים תובנה לשינויים של EVs על …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תוכנית מחקר זוטר של ננו מהמשרד הפדרלי של החינוך והמחקר, גרמניה (גרנט מספר 13XP5029A) תמך בעבודה זו. מקסימיליאן ריכטר נתמך על ידי סטודיו דה Deutschen Volkes (קרן המלגות האקדמית הגרמנית) באמצעות מלגת דוקטורט.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
Riferimenti
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
