세포 밖 소포체의 저장 안정성 평가
Summary
여기서 우리는 세포 밖 소포체의 저장 안정성을 평가 하기 위해 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제시 하 고, 세포내에서 생성 되는 자연적으로 발생 하는 나노 입자의 그룹 이다. 소포는 모형 효소로 니드로 적재 되 고 다른 조건 하에서 저장 됩니다. 저장 후,이의 물리 화학적 매개 변수와 캡슐화 된 효소의 활성이 평가 됩니다.
Abstract
세포 밖 소포 (EVs)는 약물, 약물 운반체 및 바이오 마커로 서 사용 되는 현재 연구에서 유망한 표적 이다. 그들의 임상 발달을 위해, 그들의 약 제 활동은 중요 합니다 뿐만 아니라 그들의 생산은 평가 될 필요가 있습니다. 이 맥락에서 연구는 EVs, 특성 및 저장소의 격리에 중점을 둡니다. 본 원고는 유전 조작 또는 특정 기능 분석 없이 EVs에 대 한 다양 한 저장 조건의 효과를 평가 하기 위한 간편한 절차를 제공 하는 것을 목표로 합니다. 이를 통해 주어진 보관 조건 하에서 EVs의 안정성에 대 한 첫 인상을 신속 하 게 얻을 수 있으며, 다른 셀 소스에서 추출한 EVs는 쉽게 비교 가능 합니다. 안정성 측정은 EVs의 물리 화학적 매개 변수 (크기, 입자 농도 및 형태) 및 화물의 활동 보존에 기반 합니다. 후자는 베타-니드 효소의 사포닌 매개 캡슐화에 의해 Ev로 평가 된다. 니드는 대리로 서 작용 하 고 형광 성 리포터 분자의 절단을 통해 쉬운 정량화를 허용 합니다. 본 프로토콜은 임상 적용에 대 한 EV 연구를 진행 하기 위해 EV 특성을 최적으로 유지 하는 저장 조건 검색에서 연구자를 위한 도구가 될 수 있습니다.
Introduction
EVs는 거의 모든 세포 유형에 의해 생성 된 멤브레인 결합 나노 입자입니다. 포유류 세포의 경우, EVs는 별개의 생산 경로1,2로 두 개의 주요 그룹으로 세분 될 수 있습니다. 대략 100-1000 nm에서 크기 범위를 가진 막 소포는, 세포 막에서 직접 신진에 의해 생성 됩니다. 크기 30-200 nm의 엑 소 솜은 내 면으로 형성 되 고, 이어서 세포 막과 융합 하 여 여러 개의 엑 소 좀을 한 번에 방출 하는 다발 골 조직 으로부터 유래한 다. 이 소포의 주요 기능은 세포3사이의 정보 전송입니다. 이 목적을 위해, RNA, DNA 및 단백질과 같은 화물는 활발히 그들로 분류 됩니다. EVs는 건강과 질병 상태 모두에 영향을 미치는 다양 한 효과를 대상에 게 전달할 수 있습니다. 한쪽에는 조직 재생, 항 원 제시 또는 항생제 효과와 같은 긍정적 인 효과를 매개 하 여 치료제4,5로 서의 발달에 대 한 길 조 표적을 만듭니다. 다른 측면에서, Ev는 종양 혈관 신생을 촉진할 수있고, 스트레스 반응7에서 바이 스탠 스 효과를 유도 하 고, 자가 면역 질환8 및 염증 성 질환9에서 역할을 할 수도 있다. 따라서, 그들은 많은 병리학 적 효과의 더 나은 이해에 핵심 구성 요소가 될 수 있습니다. 그러나 암10,11,12 및 심혈 관 질환과 같은 매니 폴드 질환에서 변경 된 EVs가 존재하 고 혈액과 소변에서의 손쉬운 접근이 이상적입니다. 바이오 마커. 마지막으로, 그들의 좋은 생체 적합성14 그리고 그들의 내재 된 표적 능력은 ev도 마약 배달에 대 한 흥미로운 만들기15. 이 원고에서, 우리는 포유류 세포 로부터 유래 된 EVs의 저장 안정성을 평가 하기 위한 프로토콜을 설명 하며, 여전히 거의 조사 되지 않는 중요 한 성질 이다.
EVs의 임상 발달을 위해, 그들의 치료 효과, 생산, 정제 및 저장17의 평가를 포함 하 여 극복16에 많은 장애물이 아직도 있습니다. -80 ° c는 EV 저장 장치 (18)의 표준으로 널리 볼 수 있는 반면, 필요한 냉동 고는 비용이 많이 들며, 생산에서 요구 되는 콜드 체인을 환자에 게 유지 하는 것은 쉽지 않은 일입니다. 또한 일부 보고서는-80 ° c에서 스토리지가 EVs를 최적으로 유지 하지 못하고 ev 기능19,20에서 손실을 유발 한다고 표시 합니다. 동결 건조 (21),22 또는 분무 건조 (23)와 같은 다른 방법은 EVs의 냉동 저장에 대 한 잠재적인 대체물로 제안 되었다.
저장 안정성을 평가 하는 최적의 방법은 기능적 분석에서 EVs를 테스트 하거나 특정 마커의 평가 (예를 들어, 항균 활성19)를 검사 하는 것입니다. 이것은 소포에 대 한 원하는 효과가 알려져 있을 때 그리고 하나의 별개의 EVs 그룹이 연구 될 때 가능 합니다. 상이한 세포 공급원 으로부터의 EVs가 비교 될 경우 (예를 들어, 약물 캡슐화) 또는 알려진 기능적 판독 기능이 없는 경우, 저장에의 한 변화를 직접적으로 평가할 수 없게 된다.
한편, 최근 특허20에 나타난 바와 같이, 크기, 입자 회수 및 단백질 농도와 같은 물리 화학적 파라미터의 변화를 평가 하는 것 만으로도 EV 활성의 변화를 항상 예측 하는 것은 아니다.
여기에서, 우리는 EVs의 화물을 위한 대리로 캡슐화 된 베타-니드 효소의 활동과 결합 된 물리 화학적 매개 변수를 평가 함으로써 EVs의 저장 안정성을 측정 하는 즉시 적용 가능한 프로토콜을 제공 합니다. 효소의 로딩은 상이한 공급원21,24,25로부터의 EVs와 함께 확립 된 온화한 방법으로 사포닌 배양에 의해 이루어진다. 사포닌은 EV 막에 과도 기공을 형성 하 여 소포에 효소 흡수를 허용 합니다. 효소는 불리 한 저장 조건을 복종 하는 경우에 그들의 활동을 분실 하는 경향이 있기 때문에, 그들은 EVs의 기능적인 화물의 보전의 평가를 위한 이상적인 대리입니다.
우리는 인간 간 엽 줄기 세포 (MSCs), 인간 탯 줄 정 맥 내 피 세포 (HUVECs) 및 인간 선 암 폐 포 상피 세포 (A549) 로부터 유도 된 EVs에이 프로토콜을 적용 하는 것이 실제로 큰 차이를 초래 한다는 것을 입증 했습니다 EV 소스 (21)를 선택할 때 고려해 야 할 다른 셀 라인 사이의 저장 안정성.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고에서는 다양 한 보관 조건에서 EVs의 안정성을 연구 하기 위한 종합적인 프로토콜을 제시 합니다. 캡슐화 된 니드을 기능적 판독 및 EVs의 물리 화학적 파라미터의 평가와 결합 하 여,이 프로토콜은 EVs의 간단한 저장 안정성 평가와 다른 셀의 EVs 비교를 허용 합니다. 라인. SEM 및 TEM을 보완 방법으로 사용 하면 단일 입자 수준에서 EVs의 변화에 대 한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 여기에 제시 된…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
독일 교육 연구 부 (보조금 번호 13XP5029A)의 나노 Matfutur 주니어 연구 프로그램은이 작업을 지원 했다. 막시밀리안 리히터는 박사 펠로 우 십을 통해 유스호스텔 Volkes (독일 학술 장학 재단)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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