Ekstrasellüler veziküllerin depolama Istikrarı değerlendirilmesi
Summary
Burada, hücre tarafından üretilen doğal Nano opartiküllerden oluşan bir grup olan ekstrüllüler veziküller için depolama kararlılığını değerlendirmek üzere kolayca uygulanabilir bir protokol sunuyoruz. Veziküller bir model enzim olarak glukuronidaz ile yüklenir ve farklı koşullarda saklanır. Depodan sonra, fizikokimyasal parametreleri ve kapsüllenmiş enzimin aktivitesi değerlendirilir.
Abstract
Ekstrelüler veziküller (EVs), ilaç, uyuşturucu taşıyıcıları ve Biyomarkörler olarak kullanılmak üzere mevcut araştırmalarda umut verici hedeflerdir. Onların klinik gelişimi için, sadece onların ilaç aktivitesi önemli değil, aynı zamanda üretim değerlendirilmesi gerekir. Bu bağlamda araştırma, EVs yalıtımına, onların karakterizasyonu ve depolarına odaklanır. Mevcut el yazısı, genetik manipülasyon veya spesifik fonksiyonel etkileri olmadan, EVs üzerinde farklı depolama koşullarının etkisini değerlendirmek için bir facile prosedürü sağlamayı amaçlamaktadır. Bu mümkün hızlı bir şekilde belirli bir depolama koşulu altında EVs istikrarı bir ilk izlenim almak için yapar, ve farklı hücre kaynaklarından türetilen EVs kolayca karşılaştırılabilir. Kararlılık ölçümü, EVs (boyut, parçacık konsantrasyonu ve morfoloji) ve onların kargo aktivitesinin korunması fizikokimyasal parametrelerine dayanır. İkincisi, EVS içine enzim Beta-glukuronidaz saponin-aracılı kapsülleme tarafından değerlendirilir. Glukuronidaz bir vekil olarak davranır ve bir floresan muhabir molekül bölünmesini ile kolay bir kantifikasyon sağlar. Mevcut protokol, klinik uygulamaya doğru EV araştırmalarını ilerletmek için EV özelliklerini en iyi şekilde korumak için depolama koşulları arayışında araştırmacılar için bir araç olabilir.
Introduction
EVs membran bağlı nanopartiküller neredeyse tüm hücre türleri tarafından üretilmektedir. Memeli hücreler için, EVS farklı üretim yolları1,2ile iki ana gruba ayrılabilir. Membran veziküller, yaklaşık 100-1000 Nm boyutunda bir boyutla, hücre zarından doğrudan tomurcuklanma tarafından üretilmektedir. Exosomes, ölçekli 30-200 Nm, daha sonra aynı anda birden fazla exosomes serbest bırakmak için hücre membranı ile sigorta endosomes içine içeri tomurcuklanan tarafından oluşturulan multiveziküler organları türetilmiştir. Bu veziküllerin ana fonksiyonu hücreler arasında bilgi taşımacılığında3. Bu amaçla RNA, DNA ve proteinler gibi kargolar aktif olarak onlara sıralanmaktadır. EVs, hem sağlık hem de hastalık durumunun etkileri ile hedefleri üzerinde çeşitli efektler iletebilir. Bir tarafta, onlar tedavi olarak gelişimi için onları uğurlu hedefler kılan doku rejenerasyon, antijen sunumu veya antibiyotik etkileri gibi olumlu etkileri Arabulmak4,5. Diğer tarafta, EVs tümör vaskülarizasyonu teşvik edebilir6, stres tepkiler7seyirci etkileri, ve otoimmün hastalıklarda rol oynayabilir8 ve inflamatuar hastalıklar9. Böylece, birçok patolojik etkinin daha iyi anlaşılması için önemli bir bileşen olabilirler. Ancak, manifold hastalıklarında değiştirilmiş EVS varlığı, kanser gibi10,11,12 ve kardiyovasküler bozukluklar13, ve kan ve idrar kolay erişilebilirlik onları ideal hale getirir biyolojik. Son olarak, onların iyi biyouyumluluk14 ve onların içsel hedefleme yeteneği EVS de ilaç teslim15için ilginç hale. Bu yazıda, hala az incelenmiş önemli bir özellik olan memeliler hücrelerinden elde edilen EVs ‘nin depolama kararlılığının değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.
EVs ‘nin klinik gelişimi için, tedavi edici etkileri, üretim, arıtma ve depolama17‘ nin değerlendirilmesi de dahil olmak üzere16‘ nın üzerinde hala birçok engel vardır. Süre-80 ° c, EV depolama18için altın standart olarak yaygın olarak görülür, gerekli dondurucular pahalıdır ve üretim hasta için gerekli soğuk zincir korumak zor olabilir. Dahası, bazı raporlar, depolama-80 °c ‘ de hala en iyi şekilde EVS koruymaz ve ev işlevselliği19,20bir kayıp indükler gösterir. Freeze-kurutma21,22 veya sprey-kurutma23gibi diğer yöntemler, EVS dondurulmuş depolama için potansiyel alternatifler olarak önerilmiştir.
Depolama stabilitesini değerlendirmesinin en uygun yolu, EVs ‘i fonksiyonel testlerle veya belirli bir işaretçinin değerlendirilmesiyle, örneğin antibakteriyel aktivitesi19‘ a test etmek olacaktır. Bu veziküller istenen etkisi bilindiğinde ve bir ayrı grup EVs incelenecek olduğunda mümkündür. Farklı hücre kaynaklarından EVs karşılaştırıldığında (örneğin, ilaç Kapsülleme için) veya bilinen işlevsel bir okuma yoksa, artık değişiklikleri doğrudan bir şekilde depolama nedeniyle değerlendirmek mümkün değildir.
Öte yandan, sadece kendi fizikokimyasal parametrelerinde değişiklikleri değerlendirmek, boyut gibi, parçacık kurtarma, ve protein konsantrasyonu, her zaman değişiklikler tahmin etmez EV aktivite, son patent gösterildiği gibi20.
Burada, EVS ‘in kargo için bir vekil olarak bir kapsüllü Beta-glukuronidaz enziminin aktivitesi ile birlikte fizikokimyasal parametrelerini değerlendirerek, ailelerinin depolama kararlılığını ölçmek için kolayca uygulanabilir bir protokol sağlıyoruz. Enzim yükleme saponin inkübasyon tarafından yapılır, farklı kaynaklardan EVS ile kurulan hafif bir yöntem21,24,25. Saponin, EV membranında enzim alımı sağlayan geçici gözenekleri oluşturur. Enzimlerin etkinliğini kaybetmek eğilimli olduğu gibi olumsuz depolama koşullarına tabi, onlar EVs fonksiyonel kargoların korunması değerlendirilmesi için ideal bir vekil vardır.
Bu protokol uygulamasının insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSCS), insan göbek ven endotel hücrelerinden (huvecs) ve insan adenokarsinoma alveolar epitelyal hücrelerden (A549) elde edilmesi, gerçekten de büyük farklılıklar ortaya koyduğunu göstermiştir EV kaynak21seçerken dikkate alınmalıdır farklı hücre hatları arasında depolama stabilitesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yazıda, EVs ‘in farklı depolama koşullarında istikrarını incelemek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Fonksiyonel bir okuma ve EVs fizikokimyasal parametrelerin değerlendirilmesi olarak kapsüllenmiş glukuronidaz kombinasyonu ile, protokol EVs ve farklı hücreden EVs karşılaştırılması basit bir depolama stabilitesi değerlendirilmesi için izin verir Satır. SEM ve TEM, tamamlayıcı yöntemler olarak tek parçacık düzeyinde EVs değişikliklerine ilişkin bir anlayış sağlar. Burada sunulan so…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı NanoMatFutur küçük araştırma programı, Almanya (Grant numarası 13XP5029A) bu işi destekliyor. Maximilian Richter, Doktora Bursu ile Studienstiftung des Deutschen Volkes (Alman Akademik Burs Vakfı) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
Riferimenti
- Stremersch, S., De Smedt, S. C., Raemdonck, K. Therapeutic and diagnostic applications of extracellular vesicles. Journal of Controlled Release. 244, 167-183 (2016).
- Fuhrmann, G., Herrmann, I. K., Stevens, M. M. Cell-derived vesicles for drug therapy and diagnostics: Opportunities and challenges. Nano Today. 10 (3), 397-409 (2015).
- Goes, A., Fuhrmann, G. Biogenic and Biomimetic Carriers as Versatile Transporters To Treat Infections. ACS Infectious Diseases. 4 (6), 881-892 (2018).
- György, B., Hung, M. E., Breakefield, X. O., Leonard, J. N. Therapeutic Applications of Extracellular Vesicles: Clinical Promise and Open Questions. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 55, 439-464 (2015).
- Schulz, E., et al. Biocompatible bacteria-derived vesicles show inherent antimicrobial activity. Journal of Controlled Release. 290, 46-55 (2018).
- Feng, Q., et al. A class of extracellular vesicles from breast cancer cells activates VEGF receptors and tumour angiogenesis. Nature Communications. 8, 14450 (2017).
- Bewicke-Copley, F., et al. Extracellular vesicles released following heat stress induce bystander effect in unstressed populations. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1340746 (2017).
- Xu, Y., et al. Macrophages transfer antigens to dendritic cells by releasing exosomes containing dead-cell-associated antigens partially through a ceramide-dependent pathway to enhance CD4(+) T-cell responses. Immunology. 149 (2), 157-171 (2016).
- Buzas, E. I., György, B., Nagy, G., Falus, A., Gay, S. Emerging role of extracellular vesicles in inflammatory diseases. Nature Reviews Rheumatology. 10, 356 (2014).
- Rajappa, P., et al. Malignant Astrocytic Tumor Progression Potentiated by JAK-mediated Recruitment of Myeloid Cells. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 23 (12), 3109-3119 (2017).
- Umezu, T., et al. Exosomal miR-135b shed from hypoxic multiple myeloma cells enhances angiogenesis by targeting factor-inhibiting HIF-1. Blood. 124 (25), 3748-3757 (2014).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Boulanger, C. M., Loyer, X., Rautou, P. -. E., Amabile, N. Extracellular vesicles in coronary artery disease. Nature Reviews Cardiology. 14, 259 (2017).
- Zhu, X., et al. Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from HEK293T cells. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).
- Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 106, 148-156 (2016).
- Ingato, D., Lee, J. U., Sim, S. J., Kwon, Y. J. Good things come in small packages: Overcoming challenges to harness extracellular vesicles for therapeutic delivery. Journal of Controlled Release. 241, 174-185 (2016).
- Gimona, M., Pachler, K., Laner-Plamberger, S., Schallmoser, K., Rohde, E. Manufacturing of Human Extracellular Vesicle-Based Therapeutics for Clinical Use. International Journal of Molecular Sciences. 18 (6), 1190 (2017).
- Jeyaram, A., Jay, S. M. Preservation and Storage Stability of Extracellular Vesicles for Therapeutic Applications. The AAPS Journal. 20 (1), 1 (2017).
- Lőrincz, &. #. 1. 9. 3. ;. M., et al. Effect of storage on physical and functional properties of extracellular vesicles derived from neutrophilic granulocytes. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25465 (2014).
- Kreke, M., Smith, R., Hanscome, P., Peck, K., Ibrahim, A. Processes for producing stable exosome formulations. US patent. , (2016).
- Frank, J., et al. Extracellular vesicles protect glucuronidase model enzymes during freeze-drying. Scientific Reports. 8 (1), 12377 (2018).
- Charoenviriyakul, C., Takahashi, Y., Nishikawa, M., Takakura, Y. Preservation of exosomes at room temperature using lyophilization. International Journal of Pharmaceutics. 553 (1), 1-7 (2018).
- Kusuma, G. D., et al. To Protect and to Preserve: Novel Preservation Strategies for Extracellular Vesicles. Frontiers in Pharmacology. 9 (1199), (2018).
- Haney, M. J., et al. Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson’s disease therapy. Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).
- Fuhrmann, G., Serio, A., Mazo, M., Nair, R., Stevens, M. M. Active loading into extracellular vesicles significantly improves the cellular uptake and photodynamic effect of porphyrins. Journal of Controlled Release. 205, 35-44 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 19671 (2013).
- Vestad, B., et al. Size and concentration analyses of extracellular vesicles by nanoparticle tracking analysis: a variation study. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1344087 (2017).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Scientific Reports. 6, 36162 (2016).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential – What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24858 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Patel, D. B., et al. Impact of cell culture parameters on production and vascularization bioactivity of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles. Bioengineering & Translational Medicine. 2 (2), 170-179 (2017).
- Gardiner, C., et al. Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey. Journal of Extracellular Vesicles. 5 (1), 32945 (2016).
- Zhang, H., et al. Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation. Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
