Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Summary

Hier legen wir ein leicht anwendbares Protokoll vor, um die Speicherstabilität von extrazellulären Bläschen zu beurteilen, einer Gruppe natürlich vorkommender Nanopartikel, die von Zellen produziert werden. Die Vesikel werden als Modellenzym mit Glucuronidase beladen und unter unterschiedlichen Bedingungen gelagert. Nach der Lagerung werden ihre physikalisch-chemischen Parameter und die Aktivität des verkapselten Enzyms ausgewertet.

Abstract

Extrakelluläre Bläschen (EVs) sind vielversprechende Ziele in der aktuellen Forschung, die als Medikamente, Drogenträger und Biomarker eingesetzt werden sollen. Für ihre klinische Entwicklung ist nicht nur ihre pharmazeutische Aktivität wichtig, sondern auch ihre Produktion muss bewertet werden. In diesem Zusammenhang konzentriert sich die Forschung auf die Isolierung von Elektrofahrzeugen, ihre Charakterisierung und ihre Lagerung. Das vorliegende Manuskript zielt darauf ab, ein oberflächliches Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen unterschiedlicher Lagerbedingungen auf Elektrofahrzeuge zu ermöglichen, ohne genetische Manipulation oder spezifische funktionale Untersuchungen. So kann man sich schnell einen ersten Eindruck von der Stabilität von Elektrofahrzeugen unter einem bestimmten Speicherzustand verschaffen und aus verschiedenen Zellquellen abgeleitete Varianten leicht vergleichen. Die Stabilitätsmessung basiert auf den physikalisch-chemischen Parametern der EVs (Größe, Partikelkonzentration und Morphologie) und der Erhaltung der Ladungsaktivität. Letzteres wird durch die Saponin-vermittelte Verkapselung des Enzyms Beta-Glucuronidase in die EVs bewertet. Glucuronidase fungiert als Leihmutter und ermöglicht eine einfache Quantifizierung über die Spaltung eines fluoreszierenden Reportermoleküls. Das vorliegende Protokoll könnte ein Instrument für Forscher bei der Suche nach Speicherbedingungen sein, die die EV-Eigenschaften optimal behalten, um die EV-Forschung in Richtung klinischer Anwendung voranzutreiben.

Introduction

Es handelt sich dabei um membrangebundene Nanopartikel, die von fast allen Zelltypen hergestellt werden. Für Säugetierzellen können Elektroautos in zwei Hauptgruppen mit unterschiedlichen Produktionswegen 1,2 unterteilt werden. Membranbläschen mit einer Größe von ca. 100-1000 nm werden durch direktes Kleben aus der Zellmembran hergestellt. Exosome, die 30-200 nm groß sind, werden von multivesiculären Körpern abgeleitet, die durch innere Einkeimende in Endosomen gebildet werden, die sich anschließend mit der Zellmembran verschmelzen, um mehrere Exosomen auf einmal freizugeben. Die Hauptfunktion dieser Bläschen ist der Transport von Informationen zwischen denZellen 3. Dazu werden Ladungen wie RNA, DNA und Proteine aktiv in sie einsortiert. EVs können eine Vielzahl von Auswirkungen auf ihre Ziele vermitteln, mit Auswirkungen auf Gesundheit und Krankheitszustand. Auf der einen Seite vermitteln sie positive Effekte wie Geweberegeneration, Antigen-Präsentation oder Antibiotika-Effekte, die sie zu günstigen Zielen für ihre Entwicklung als Therapeutika^4,5machen. Auf der anderen Seite können Elektrofahrzeuge die Tumorvasskularisierung 6fördern, bei Stressreaktionen 7 zu Nebenwirkung von Gegensenzeneffekten^führenund bei Autoimmunerkrankungen 8 und Entzündungskrankheiten 9 eine Rolle spielen. Sie könnten daher eine Schlüsselkomponente für ein besseres Verständnis vieler pathologischer Effekte sein. Das Vorhandensein von veränderten Elektroautos bei vielfältigen Erkrankungen, wie Krebs^{10, 11,}12^undHerz-Kreislauf-Erkrankungen 13,^und ihre einfache Zugänglichkeit in Blut und Urin macht sie ideal Biomarker. Schließlich machen ihre gute Bioverträglichkeit 14 und ihre ihm innewohnende Targeting-Fähigkeit^EVs auch für die Medikamentenzufuhr 15 interessant. In diesem Manuskript beschreiben wir ein Protokoll zur Bewertung der Speicherstabilität von Elektrofahrzeugen, die von Säugetierzellen abgeleitet werden, eine wichtige Eigenschaft, die noch wenig erforscht ist.

Für die klinische Entwicklung von Elektrofahrzeugen gibt es noch viele Hindernisse für die Übermontage 16, einschließlich der Bewertung ihrer therapeutischen Wirkungen, Produktion, Reinigung und Lagerung¹⁷. Während-80 ° C weithin als Goldstandard^fürdie EV-Lagerung 18 angesehen wird, sind die benötigten Gefrierschränke teuer, und die Aufrechterhaltung der benötigten Kühlkette von der Produktion bis zum Patienten kann eine Herausforderung sein. Darüber hinaus deuten einige Berichte darauf hin, dass die Lagerung bei-80 ° C den Elektro-und Restbetrag noch nicht optimal bewahrt und einen Verlust an EV-Funktionalität^{19,20verursacht}. Andere Methoden, wie das Gefriertrocknen 21^,22 oder die Spritztrocknung 23, wurden als mögliche Alternativen zur Tiefkühllagerung von Elektrofahrzeugen vorgeschlagen.

Die optimale Möglichkeit, die Speicherstabilität zu beurteilen, wäre, die EVs in funktionellen Assays zu testen oder durch die Auswertung eines bestimmten Markers, zum Beispiel ihrer antibakteriellen^{Aktivität 19}. Dies ist möglich, wenn die gewünschte Wirkung der Bläschen bekannt ist und eine bestimmte Gruppe von Elektrofahrzeugen untersucht werden soll. Wenn Elektro-und Zellquellen verglichen werden sollen (z.B. für die Medikamentenverkapselung) oder wenn es keine funktionelle Auslesung gibt, ist es nicht mehr möglich, Veränderungen aufgrund der Lagerung direkt zu beurteilen.

Auf der anderen Seite prognostiziert die einfache Bewertung von Veränderungen ihrer physikalisch-chemischen Parameter, wie Größe, Partikelwiederherstellung und Proteinkonzentration, nicht immer Veränderungen in der EV-Aktivität, wie in einem kürzlichveröffentlichten Patent 20 gezeigt wurde.

Hier stellen wir ein leicht anwendbares Protokoll zur Messung der Lagerstabilität von Elektrofahrzeugen zur Verfügung, indem wir ihre physikalisch-chemischen Parameter in Kombination mit der Aktivität eines verkapselten Beta-Glucuronidase-Enzyms als Ersatz für die Ladung der Elektrofahrzeuge bewerten. Die Belastung des Enzyms erfolgt durch Saponin-Inkubation, eine milde Methode^,die mit EVs aus verschiedenen Quellen 21,24^{,25hergestellt}wird. Saponin bildet in der EV-Membran vergängliche Poren, die die Enzymaufnahme in die Bläschen ermöglichen. Da Enzyme dazu neigen, ihre Aktivität zu verlieren, wenn sie ungünstigen Lagerbedingungen ausgesetzt sind, sind sie ein idealer Ersatz für die Bewertung der Erhaltung der Funktionsgüter der Elektrofahrzeuge.

Wir haben gezeigt, dass die Anwendung dieses Protokolls auf alle, die von menschlichen mesenchymalen Stammzellen (MSCs), menschlichen Nabelvein-Endothelzellen (HUVECs) und menschlichen Adenokarzinomen alveolare Epithelzellen (A549) abgeleitet werden, tatsächlich zu großen Unterschieden in der Speicherstabilität zwischen verschiedenen Zelllinien, die bei der Auswahl der EV-Quelle 21 berücksichtigt werden sollte.

Protocol

1. Zellkultur und die Produktion von zellkonditionierten Medium In der Regel werden Zellen unter den für die jeweilige Zelllinie erforderlichen individuellen Bedingungen kultiviert. Die Zellen 24-72 h in serumfreien Bedingungen oder in Medium mit EV-abgereichertem fetalen Rinderserum (FBS) für 24-72 h kultivieren.Hinweis: Wenn EV-erschöpfte FBS verwendet wird, verwenden Sie eine Methode, die nachweislich das Serum effizient erschöpft, um eine Kontamination mit Rinder-Serum-abgeleiteten EVs 26 …

Representative Results

Abbildung 1 zeigt die Speichereigenschaften von von HUVECs isolierten Elektrofahrzeugen. Die EVs wurden von UC isoliert, die Glucuronidase gekapselt, und nach SEC wurden die gereinigten Elektrofahrzeuge von NTA auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften hin bewertet. Eine Probe der Bläschen wurde anschließend einer AF4-Reinigung unterzogen und die Glucuronidase-Aktivität gemessen. Die Bläschen wurden dann für 7 d bei 4 ° C oder-80 ° C und bei 4 ° C in lyophilisiert…

Discussion

In diesem Manuskript stellen wir ein umfassendes Protokoll vor, um die Stabilität von Elektrofahrzeugen unter verschiedenen Lagerbedingungen zu untersuchen. Mit der Kombination aus verkapselter Glucuronidase als funktioneller Auslesung und der Auswertung der physikalisch-chemischen Parameter der EVs ermöglicht das Protokoll eine einfache Speicherstabilitätsbewertung von Elektroautos und den Vergleich von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Zellen text. SEM und TEM als komplementäre Methoden ermöglichen einen Einblic…

Materials

1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC