बाह्य पुटिका के भंडारण स्थिरता का मूल्यांकन
Summary
यहाँ हम एक सहज लागू प्रोटोकॉल extracellular vesicles के भंडारण स्थिरता का आकलन करने के लिए प्रस्तुत, स्वाभाविक रूप से घटनेवाला नैनोकणों के एक समूह कोशिकाओं द्वारा उत्पादित. पुटिकाओं एक मॉडल एंजाइम के रूप में glucuronidase के साथ भरी हुई है और विभिन्न परिस्थितियों में संग्रहीत किया जाता है । भंडारण के बाद उनके भौतिकोरासायनिक मापदंडों और समझाया एंजाइम की गतिविधि का मूल्यांकन कर रहे हैं ।
Abstract
Extracellular पुटिकाओं (evs) वर्तमान अनुसंधान में आशाजनक लक्ष्य हैं, दवाओं के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए, दवा वाहक, और biomarkers. उनके नैदानिक विकास के लिए, न केवल उनकी दवा गतिविधि महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी उनके उत्पादन के लिए मूल्यांकन की जरूरत है । इस संदर्भ में, अनुसंधान EVs के अलगाव, उनके लक्षण वर्णन, और उनके भंडारण पर केंद्रित है । वर्तमान पांडुलिपि का उद्देश्य आनुवंशिक हेरफेर या विशिष्ट कार्यात्मक assays बिना evs पर विभिंन भंडारण शर्तों के प्रभाव के मूल्यांकन के लिए एक फेसियल प्रक्रिया प्रदान करना है । यह जल्दी से एक दिया भंडारण हालत के तहत EVs की स्थिरता की पहली छाप पाने के लिए संभव बनाता है, और विभिन्न सेल स्रोतों से व्युत्पंन EVs आसानी से तुलना की जा सकती है. स्थिरता माप EVs (आकार, कण एकाग्रता, और आकारिकी) और उनके कार्गो की गतिविधि के संरक्षण के भौतिकोरासायनिक मापदंडों पर आधारित है । बाद के द्वारा मूल्यांकन किया जाता है saponin-mediated एंजाइम बीटा-glucuronidase EVs में. Glucuronidase एक किराए के रूप में कार्य करता है और एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर अणु की दरार के माध्यम से एक आसान मात्रा के लिए अनुमति देता है । वर्तमान प्रोटोकॉल भंडारण की स्थिति की खोज में शोधकर्ताओं के लिए एक उपकरण हो सकता है जो नैदानिक अनुप्रयोग की ओर ev अनुसंधान को उन्नत करने के लिए EV संपत्तियों को बेहतर बनाए रखते हैं ।
Introduction
EVs झिल्ली से बंधे नैनोकणों लगभग सभी प्रकार के सेल द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, evs अलग उत्पादन रास्ते1,2के साथ दो मुख्य समूहों में subdivided किया जा सकता है । झिल्ली vesicles, लगभग 100-1000 एनएम से एक आकार सीमा के साथ, सीधे कोशिका झिल्ली से नवोदित द्वारा उत्पादित कर रहे हैं । Exosomes, 30-200 एनएम आकार, आवक द्वारा गठित multivesicular निकायों से व्युत्पंन है endosomes में है कि बाद में सेल झिल्ली के साथ फ्यूज के लिए एक बार में एकाधिक exosomes जारी । इन पुटिकाओं के मुख्य समारोह कोशिकाओं3के बीच सूचना के परिवहन है । इस उद्देश्य के लिए, आरएनए, डीएनए, और प्रोटीन जैसे कार्गोस सक्रिय रूप से उन में हल कर रहे हैं । EVs अपने लक्ष्य पर प्रभाव की एक किस्म है, दोनों स्वास्थ्य और रोग राज्य के लिए निहितार्थ के साथ व्यक्त कर सकते हैं । एक तरफ, वे ऊतक पुनर्जनन, प्रतिजन प्रस्तुति, या एंटीबायोटिक प्रभाव, जो उंहें चिकित्सा विज्ञान के रूप में उनके विकास के लिए शुभ लक्ष्य बनाता है के रूप में सकारात्मक प्रभाव मध्यस्थता4,5। दूसरी तरफ, evs ट्यूमर वाहिकीयकरण6को बढ़ावा देने के कर सकते हैं, तनाव प्रतिक्रिया7में दर्शक प्रभाव को प्रेरित, और स्व-प्रतिरक्षित रोग8 और भड़काऊ रोगों9में एक भूमिका निभा सकता है । इस प्रकार, वे कई रोग प्रभाव की एक बेहतर समझ के लिए एक महत्वपूर्ण घटक हो सकता है । हालांकि, कई गुना रोगों में बदल evs की उपस्थिति, जैसे कैंसर10,11,12 और हृदय विकारों13, और रक्त और मूत्र में उनकी आसान पहुँच उन्हें आदर्श बनाता है Biomarkers. अंत में, उनकी अच्छी biocompatibility14 और उनके अंतर्निहित लक्ष्यीकरण क्षमता evs भी दवा वितरण15के लिए दिलचस्प बनाते हैं । इस पांडुलिपि में, हम स्तनधारी कोशिकाओं से व्युत्पंन EVs के भंडारण स्थिरता के मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन, एक महत्वपूर्ण संपत्ति है कि अभी भी थोड़ा जांच की है ।
Evs के नैदानिक विकास के लिए, वहां अब भी कर रहे है कई बाधाओं को16जीतना, उनके उपचारात्मक प्रभाव, उत्पादन, शुद्धि, और भंडारण के मूल्यांकन सहित17। जबकि-८० ° c EV संग्रहण के लिए स्वर्ण मानक के रूप में व्यापक रूप से देखा जाता है18, आवश्यक फ्रीजर महंगे हैं, और उत्पादन से रोगी के लिए आवश्यक शीत श्रृंखला को बनाए रखने चुनौतीपूर्ण हो सकता है । इसके अलावा, कुछ रिपोर्टों से संकेत मिलता है कि पर भंडारण-८० डिग्री सेल्सियस अभी भी इष्टतम evs को बरकरार रखता है और EV कार्यशीलता में एक नुकसान लाती19,20। अंय तरीकों, जैसे फ्रीज-सुखाने21,22 या स्प्रे सुखाने23, evs के जमे हुए भंडारण के लिए संभावित विकल्प के रूप में प्रस्तावित किया गया है ।
भंडारण स्थिरता का आकलन करने का इष्टतम तरीका कार्यात्मक assays हैं या एक विशिष्ट मार्कर के मूल्यांकन से EVs परीक्षण करने के लिए किया जाएगा, उदाहरण के लिए, उनके जीवाणुरोधी गतिविधि19. यह संभव है जब पुटिकाओं के वांछित प्रभाव जाना जाता है और जब evs के एक विशिष्ट समूह का अध्ययन किया जाना है । यदि अलग सेल स्रोतों से EVs (उदाहरण के लिए, दवा encapsulation के लिए) की तुलना में हो रहे है या यदि कोई ज्ञात कार्यात्मक readout है, यह अब एक प्रत्यक्ष तरीके से भंडारण के कारण परिवर्तन का आकलन संभव है ।
दूसरी ओर, बस अपने भौतिक मापदंडों में परिवर्तन का मूल्यांकन, जैसे आकार, कण वसूली, और प्रोटीन एकाग्रता, हमेशा EV गतिविधि में परिवर्तन की भविष्यवाणी नहीं करता है, के रूप में हाल ही में एक पेटेंट20में दिखाया गया है ।
यहां, हम evs के भंडारण स्थिरता को मापने के लिए एक आसानी से लागू प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए evs के कार्गो के लिए एक किराए के रूप में एक समझाया बीटा glucuronidase एंजाइम की गतिविधि के साथ संयुक्त उनके भौतिक मापदंडों का आकलन । एंजाइम की लोडिंग सैपोनिन ऊष्मायन द्वारा किया जाता है, एक हल्के विभिंन स्रोतों से evs के साथ स्थापित विधि21,24,25। सैपोनइन में ईवी झिल्ली में क्षणिक रंध्र होते हैं, जो एंजाइम को पुटिका में ले जाने की अनुमति देता है । के रूप में एंजाइमों को अपनी गतिविधि खो यदि प्रतिकूल भंडारण की स्थिति के अधीन प्रवण हैं, वे evs के कार्यात्मक कारगुजारियों के संरक्षण के मूल्यांकन के लिए एक आदर्श किराए रहे हैं ।
हमने यह प्रदशत किया है कि इस प्रोटोकोल का प्रयोग मानव मध्योतक स्टेम सेल (एमएससीएस), मानव नाभि शिरा एन्डोथीलियल कोशिकाओं (ह्यूवीसेक), और मानव एडेनोकार्सिनोमा एल्वीकोलर उपकला कोशिकाओं (A549) से प्राप्त ईएचएस के लिए वास्तव में बहुत अंतर में परिणाम विभिंन सेल लाइनों, जो ध्यान में रखा जाना चाहिए जब EV स्रोत21का चयन के बीच भंडारण स्थिरता ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, हम विभिंन भंडारण की स्थिति के तहत EVs की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । एक कार्यात्मक readout के रूप में समझाया glucuronidase के संयोजन और evs के भौतिक मापदंडों के…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NanoMatFutur शिक्षा और अनुसंधान, जर्मनी (अनुदान संख्या 13XP5029A) के संघीय मंत्रालय से जूनियर अनुसंधान कार्यक्रम इस काम का समर्थन किया । एक पीएच. डी. फैलोशिप के जरिए maximilian रिक्टर को Studienstiftung des Deutschen Volkes (जर्मन अकादमिक छात्रवृत्ति फाउंडेशन) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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