Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares
Summary
Aqui nós apresentamos um protocolo prontamente aplicável para avaliar a estabilidade do armazenamento de vesicles extracelular, um grupo de nanopartículas naturais produzidas pelas pilhas. As vesículas são carregadas com glucuronidase como uma enzima modelo e armazenadas diferentes condições. Após o armazenamento, os seus parâmetros físico-químicos e a atividade da enzima encapsulada são avaliados.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são alvos promissores na pesquisa atual, usadas como drogas, portadores de drogas e biomarcadores. Para seu desenvolvimento clínico, não somente sua atividade farmacêutica é importante mas também sua produção precisa de ser avaliada. Neste contexto, a pesquisa concentra-se no isolamento de EVs, sua caracterização e seu armazenamento. O presente manuscrito tem como objetivo fornecer um procedimento facile para a avaliação do efeito de diferentes condições de armazenamento em EVs, sem manipulação genética ou ensaios funcionais específicos. Isto torna possível obter rapidamente uma primeira impressão da estabilidade de EVs uma condição de armazenamento dada, e os EVs derivados das fontes diferentes da pilha podem ser comparados facilmente. A medida de estabilidade baseia-se nos parâmetros físico-químicos dos EVs (tamanho, concentração de partículas e morfologia) e na preservação da atividade de sua carga. O último é avaliado pelo encapsulamento saponina-negociado do beta-glucuronidase da enzima nos EVs. Glucuronidase atua como um substituto e permite uma quantificação fácil através da clivagem de uma molécula de repórter fluorescente. O presente protocolo poderia ser uma ferramenta para os pesquisadores na busca de condições de armazenamento que otimamente reter Propriedades EV para avançar a pesquisa EV para aplicação clínica.
Introduction
Os EVs são nanopartículas ligadas à membrana produzidas por quase todos os tipos de células. Para as células de mamíferos, os EVS podem ser subdivididos em dois grupos principais com distintas viasdeprodução1,2. As vesículas da membrana, com uma escala do tamanho de aproximadamente 100-1000 nanômetro, são produzidas pelo brotamento direto da membrana de pilha. Os exosomas, de tamanho 30-200 nm, são derivados de corpos multivesiculares formados por brotamento interno em endosomas que posteriormente se fundem com a membrana celular para liberar vários exosomas de uma só vez. A principal função dessas vesículas é o transporte de informações entre as células3. Para esta finalidade, as cargas tais como o RNA, o ADN, e as proteínas são classificadas ativamente neles. Os EVs podem transmitir uma variedade de efeitos sobre seus alvos, com implicações tanto para a saúde quanto para o estado da doença. De um lado, eles mediam efeitos positivos como regeneração tecidual, apresentação de antígenos ou efeitos de antibióticos, o que os torna alvos auspiciosos para seu desenvolvimento como terapêutica4,5. Por outro lado, os EVs podem promover a vascularização tumoral6, induzir efeitos de espectador nas respostas de estresse7, podendo desempenhar um papel nas doenças auto-imunes8 e doenças inflamatórias9. Assim, eles podem ser um componente-chave para uma melhor compreensão de muitos efeitos patológicos. No entanto, a presença de EVS alterados em doenças múltiplas, como câncer10,11,12 e distúrbios cardiovasculares13, e sua fácil acessibilidade no sangue e na urina os torna ideais Biomarcadores. Finalmente, a sua boa biocompatibilidade14 e sua capacidade de segmentação inerente fazer EVS também interessante para a entrega de drogas15. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para a avaliação da estabilidade de armazenamento de EVs derivados de células de mamíferos, uma importante propriedade que ainda é pouco investigada.
Para o desenvolvimento clínico de EVS, ainda existem muitos obstáculos para superar16, incluindo a avaliação de seus efeitos terapêuticos, produção, purificação e armazenamento17. Enquanto-80 ° c é amplamente visto como o padrão de ouro para o armazenamento de EV18, os congeladores necessários são caros, e manter a cadeia de frio necessária a partir da produção para o paciente pode ser desafiador. Além disso, alguns relatórios indicam que o armazenamento em-80 ° c ainda não preserva otimamente EVS e induz uma perda na funcionalidade de EV19,20. Outros métodos, como liofilização21,22 ou spray-secagem23, têm sido propostos como alternativas potenciais para o armazenamento congelado de EVS.
A maneira ideal de avaliar a estabilidade do armazenamento seria testar os EVs em ensaios funcionais ou pela avaliação de um marcador específico, por exemplo, sua atividade antibacteriana19. Isso é possível quando o efeito desejado das vesículas é conhecido e quando um grupo distinto de EVs deve ser estudado. Se os EVs de diferentes fontes de células forem comparados (por exemplo, para encapsulamento de drogas) ou se não houver leitura funcional conhecida, não será mais possível avaliar as alterações devidas ao armazenamento de forma direta.
Por outro lado, a simples avaliação de alterações em seus parâmetros físico-químicos, como tamanho, recuperação de partículas e concentração proteica, nem sempre prediz mudanças na atividade de EV, como foi demonstrado em uma patente recente20.
Aqui, nós fornecemos um protocolo prontamente aplicável para medir a estabilidade do armazenamento de EVS avaliando seus parâmetros físico-químicas combinados com a atividade de uma enzima encapsulada da beta-glucuronidase como um substituto para a carga dos EVS. O carregamento da enzima é feito por incubação de saponina, um método leve estabelecido com EVS de diferentes fontes21,24,25. A saponina forma poros transitórios na membrana EV, o que permite a absorção enzimática na vesícula. Como as enzimas são propensas a perder sua atividade se submetido a condições de armazenamento desfavorável, eles são um substituto ideal para a avaliação da preservação das cargas funcionais dos EVs.
Nós demonstramos que a aplicação deste protocolo aos EVS derivados das pilhas de haste mesenquimais humanas (MSCS), das pilhas endothelial humanas da veia de cordão umbilical (HUVECs), e das pilhas epithelial alveolares humanas do adenocarcinoma (A549) resulta certamente em grandes diferenças na estabilidade de armazenamento entre diferentes linhas celulares, que devem ser levados em consideração ao escolher a fonte EV21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente para estudar a estabilidade dos EVs diferentes condições de armazenagem. Com a combinação de glucuronidase encapsulado como um leitura funcional e a avaliação dos parâmetros físico-químicas dos EVS, o protocolo permite uma avaliação de estabilidade de armazenamento direta de EVS e a comparação de EVS da pilha diferente Linhas. SEM e TEM como métodos complementares permitem uma introspecção em mudanças dos EVs no nível da único-partícula. Os result…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O programa de pesquisa Júnior NanoMatFutur do Ministério Federal da educação e pesquisa, Alemanha (Grant Number 13XP5029A) apoiou este trabalho. Maximilian Richter foi apoiado por Studienstiftung des Deutschen Volkes (Fundação alemã de bolsas acadêmicas) através de uma bolsa de doutorado.
Materials
| 1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC) | Sigma-Aldrich | P2663-25MG | |
| 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC) | Sigma-Aldrich | P4329-25MG | |
| 225 cm² cell culture flasks | Corning | 431082 | Used with 25 ml of medium |
| 30 kDa regenerated cellulose membrane | Wyatt Technology Europe | 1854 | |
| 350 µm spacer | Wyatt Technology Europe | ||
| Automated fraction collector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Beta-glucuronidase | Sigma-Aldrich | G7646-100KU | |
| Chloroform | Fisher scientific | C/4966/17 | |
| Column oven | Hitachi High-Technologies Europe | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531-10G | |
| DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector | Wyatt Technology Europe | ||
| Durapore Membrane filter, PVDF, 0,1 µm, 47 mm | Merck | VVLP04700 | Used for the preparation of buffers for AF4 |
| EBM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3156 | Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells |
| Eclipse dualtec | Wyatt Technology Europe | ||
| EGM-2 | Lonza Verviers, S.p.r. | CC-3162 | Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells |
| ELISA Plate Sealers | R&D Systems | DY992 | used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay |
| Ethanol | Fisher scientific | E/0665DF/17 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids | 610000-1EA | |
| Filter support | Avanti Polar Lipids | 610014-1EA | used for liposome preparation |
| Fluorescein di-β-D-glucoronide | Thermo Fisher Scientific | F2915 | |
| Gibco PBS-tablets+CA10:F36 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Hettich Universal 320 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting cells at 300 g | |
| Hettich Rotina 420 R | Andreas Hettich GmbH & Co.KG | Used for pelleting larger debris at 3000 g | |
| HUVEC cells | Lonza Verviers, S.p.r. | C2517A | |
| Kimble FlexColumn 1X30CM | Kimble | 420401-1030 | |
| Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC | Christ | ||
| Microcentrifuge Tubes, Polypropylene | VWR international | 525-0255 | the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery |
| Nanosight LM14 equipped with a green laser | Malvern Pananalytical | ||
| Nanosight-software version 3.1 | Malvern Pananalytical | ||
| Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes | Whatman/GE Healthcare | 110406 | used for liposome preparation |
| PEEK Inline filter holder | Wyatt Technology Europe | ||
| Phosphotungstic acid hydrate | Sigma-Aldrich | 79690-25G | |
| Polycarbonate bottles for ultracentrifugation | Beckman Coulter | 355622 | |
| QuantiPro BCA Assay Kit | Sigma-Aldrich | QPBCA-1KT | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15 | Carl Zeiss AG | ||
| Sepharose Cl-2b | GE Healthcare | 17014001 | |
| SEM copper grids with carbon film | Plano | S160-4 | |
| Small AF4 channel | Wyatt Technology Europe | ||
| Sputter-coater Q150R ES | Quorum Technologies | ||
| Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011 | Oxford Instruments | ||
| Type 45 Ti ultracentrifugation rotor | Beckman Coulter | 339160 | |
| Ultimate 3000 Dionex autosampler | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex isocratic pump | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K | Beckman Coulter | ||
| UV detector | Thermo Fisher Scientific | ||
| Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter | Whatman/GE Healthcare | 10401712 | Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC |
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