Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Summary

Her presenterer vi en lett anvendelig protokoll for å vurdere lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer, en gruppe av naturlig forekommende nanopartikler produsert av celler. Den blemmer er lastet med glucuronidase som en modell enzym og lagres under ulike forhold. Etter lagring evalueres deres fysikalsk parametre og aktiviteten til det innkapslet enzymet.

Abstract

Ekstracellulære blemmer (EV) er lovende mål i dagens forskning, som skal brukes som narkotika, narkotika-bærere, og biomarkører. For deres klinisk utvikling, ikke bare deres farmasøytiske aktivitet er viktig, men også deres produksjon må vurderes. I denne sammenhengen fokuserer forskningen på isolering av EV-er, deres karakterisering og deres lagring. Det nåværende manuskriptet tar sikte på å gi en facile prosedyre for vurdering av effekten av ulike lagringsforhold på EV ‘ r, uten genetisk manipulasjon eller spesifikke funksjonelle analyser. Dette gjør det mulig å raskt få et første inntrykk av stabiliteten til EV ‘ r under en gitt oppbevarings tilstand, og EV ‘ er avledet fra forskjellige celle kilder kan sammenlignes lett. Stabilitets målingen er basert på de fysikalsk parametrene til EV ‘ r (størrelse, partikkel konsentrasjon og morfologi) og bevaring av aktiviteten til lasten. Sistnevnte er vurdert av saponin-mediert innkapsling av enzymet beta-glucuronidase i EV ‘ r. Glucuronidase fungerer som et surrogat og gir en enkel kvantifisering via kløften av et fluorescerende reporter molekyl. Den nåværende protokollen kan være et verktøy for forskere i jakten på lagringsforhold som optimalt beholde EV egenskaper for å fremme EV forskning mot klinisk anvendelse.

Introduction

EV ‘ r er membran bundne nanopartikler produsert av nesten alle celletyper. For pattedyrceller kan EV ‘ r deles inn i to hovedgrupper med forskjellige produksjons veier^1,2. Membran blemmer, med en størrelse varierer fra cirka 100-1000 NM, produseres av direkte spirende fra cellemembranen. Exosomes, størrelse 30-200 NM, er avledet fra multivesicular organer dannet av innover spirende inn endosomes som senere sikring med cellemembranen å løslate flere Exosomes samtidig. Den viktigste funksjonen til disse blemmer er transport av informasjon mellom celler³. For dette formålet, cargos som RNA, DNA, og proteiner er aktivt sortert inn i dem. EV ‘ r kan formidle en rekke effekter på sine mål, med implikasjoner for både helse og sykdom tilstand. På den ene siden, de megle positive effekter som vev gjenfødelse, antigenpresentasjon, eller antibiotika effekter, noe som gjør dem lovende mål for sin utvikling somlegemiddel,⁵. På den andre siden kan EV-er fremme tumor endometrial blodkar⁶, indusere tilskuer effekter i stress respons⁷, og kan spille en rolle i autoimmune sykdommer⁸ og inflammatoriske sykdommer⁹. Dermed kan de være en viktig komponent til en bedre forståelse av mange patologiske effekter. Men tilstedeværelsen av endrede EV ‘ i manifold sykdommer, slik som kreft^10,11,12 og kardiovaskulære lidelser¹³, og deres lett tilgjengelighet i blod og urin gjør dem ideelle biomarkører. Endelig har deres gode biokompatibilitet¹⁴ og deres iboende målretting evne til å gjøre EV ‘ er også interessant for legemiddellevering¹⁵. I dette manuskriptet beskriver vi en protokoll for evalueringen av lagrings stabiliteten til EV-er avledet fra pattedyrceller, en viktig egenskap som fortsatt er lite undersøkt.

For den kliniske utviklingen av EV ‘ r er det fortsatt mange hindringer for overvinne¹⁶, inkludert evaluering av deres terapeutiske effekter, produksjon, rensing og lagring¹⁷. Mens-80 ° c er allment sett på som gullstandarden for EV lagring¹⁸, de nødvendige frysere er dyre, og opprettholde den nødvendige kjølekjeden fra produksjon til pasienten kan være utfordrende. Videre tyder enkelte rapporter på at lagring på-80 ° c fortsatt ikke optimalt bevarer EV ‘ er og medfører et tap i EV-funksjonalitet^19,20. Andre metoder, for eksempel frysetørking^21,22 eller spray-tørking²³, har blitt foreslått som potensielle alternativer til den frosne lagring av EV ‘ r.

Den optimale måten å vurdere lagrings stabilitet på vil være å teste EV ‘ r i funksjonelle analyser eller ved evalueringen av en bestemt markør, for eksempel deres antibakterielle aktivitet¹⁹. Dette er mulig når den ønskede effekten av blemmer er kjent og når en bestemt gruppe av EV ‘ r skal studert. Hvis EV-er fra forskjellige celle kilder skal sammenlignes (f.eks. for legemiddel innkapsling) eller hvis det ikke finnes noen kjent funksjonell avlesning, er det ikke lenger mulig å vurdere endringer på grunn av lagring på en direkte måte.

På den annen side, bare evaluere endringer i sine fysikalsk parametere, for eksempel størrelse, partikkel utvinning, og proteinkonsentrasjon, ikke alltid forutsi endringer i EV aktivitet, som har vært vist i en fersk patent²⁰.

Her gir vi en lett anvendelig protokoll for å måle lagrings stabiliteten til EV ‘ r ved å vurdere deres fysikalsk parametre kombinert med aktiviteten til et innkapslet beta-glucuronidase enzym som et surrogat for lasten av EV ‘ r. Lastingen av enzymet gjøres ved saponin inkubasjons, en mild metode etablert med EV ‘ r fra ulike kilder^21,24,25. Saponin danner forbigående porer i EV-membranen, som gjør det mulig å bruke enzym opptak i vesicle. Ettersom enzymer er tilbøyelige til å miste sin aktivitet hvis de utsettes for ugunstige lagringsforhold, er de et ideelt surrogat for evalueringen av bevaring av funksjonelle laster av EV ‘ r.

Vi har vist at anvendelsen av denne protokollen til EV ‘ r avledet fra menneskelige Mesenchymal stamceller (MSCs), menneskelig navle vene endothelial celler (HUVECs), og menneskelige adenokarsinom alveolære epitelceller (A549) faktisk føre til store forskjeller i lagrings stabilitet mellom ulike cellelinjer, som bør tas i betraktning når du velger EV kilde²¹.

Protocol

1. cellekultur og produksjon av celle-conditioned medium Vanligvis dyrke celler under de enkelte forholdene som kreves for den respektive cellelinje. Dyrke cellene for 24-72 h i serum-frie forhold eller i medium inneholder EV-utarmet fosterets storfe serum (FBS).Merk: Hvis EV-utarmet FBS brukes, bør du bruke en metode som er bevist for å effektivt tømme serum, for å hindre forurensning med blod serum avledede EV.26. Samle mediet fra flaskene. Sentrifuger på 3…

Representative Results

Figur 1 viser lagringsegenskapene til EV ‘ er isolert fra HUVECs. EV ‘ r ble isolert av UC, glucuronidase var innkapslet, og etter SEC ble renset EV ‘ r evaluert for sine fysikalsk egenskaper av NTA. En prøve av blemmer ble senere utsatt for AF4 rensing og glucuronidase aktiviteten ble målt. De blemmer ble deretter lagret i 7 d ved 4 ° c eller-80 ° c og ved 4 ° c i lyofilisert form, i sistnevnte tilfelle med tillegg av 4% trehalose. Etter lagring ble blemmer igjen målt v…

Discussion

I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll for å studere stabiliteten til EV ‘ r under forskjellige Oppbevaringsbetingelser. Med kombinasjonen av innkapslet glucuronidase som en funksjonell avlesning og evalueringen av de fysikalsk parametrene til EV ‘ r, tillater protokollen en enkel lagring stabilitets evaluering av EV ‘ r og sammenligningen av EV ‘ r fra forskjellige celle Linjer. SEM og TEM som komplementære metoder gir innsikt i endringer av EV ‘ r på enkelt partikkel nivå. Resultatene som ble p…

Materials

1,2 dimyristoyl-sn glycero-3-phospho-choline (DMPC)	Sigma-Aldrich	P2663-25MG
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-choline (DPPC)	Sigma-Aldrich	P4329-25MG
225 cm² cell culture flasks	Corning	431082	Used with 25 ml of medium
30 kDa regenerated cellulose membrane	Wyatt Technology Europe	1854
350 µm spacer	Wyatt Technology Europe
Automated fraction collector	Thermo Fisher Scientific
Beta-glucuronidase	Sigma-Aldrich	G7646-100KU
Chloroform	Fisher scientific	C/4966/17
Column oven	Hitachi High-Technologies Europe
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Aldrich	T9531-10G
DAWN HELEOS II, Multi-angle light scattering detector	Wyatt Technology Europe
Durapore Membrane filter, PVDF,  0,1 µm, 47 mm	Merck	VVLP04700	Used for the preparation of buffers for AF4
EBM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3156	Endothelial Cell Growth basal medium, used for the serum free culture of HUVEC cells
Eclipse dualtec	Wyatt Technology Europe
EGM-2	Lonza Verviers, S.p.r.	CC-3162	Endothelial Cell Growth medium, used for the normal culture of HUVEC cells
ELISA Plate Sealers	R&D Systems	DY992	used for sealing of 96-well plates for the glucuronidase assay
Ethanol	Fisher scientific	E/0665DF/17
Extruder Set With Holder/Heating Block	Avanti Polar Lipids	610000-1EA
Filter support	Avanti Polar Lipids	610014-1EA	used for liposome preparation
Fluorescein di-β-D-glucoronide	Thermo Fisher Scientific	F2915
Gibco PBS-tablets+CA10:F36	Thermo Fisher Scientific	18912014
Hettich Universal 320 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting cells at 300 g
Hettich Rotina 420 R	Andreas Hettich GmbH & Co.KG		Used for pelleting larger debris at 3000 g
HUVEC cells	Lonza Verviers, S.p.r.	C2517A
Kimble  FlexColumn 1X30CM	Kimble	420401-1030
Lyophilizer ALPHA 2-4 LSC	Christ
Microcentrifuge Tubes, Polypropylene	VWR international	525-0255	the tubes used for all EV-handling, found to be more favorable than comparable products from other suppliers regarding particle recovery
Nanosight LM14 equipped with a green laser	Malvern Pananalytical
Nanosight-software version 3.1	Malvern Pananalytical
Nucleopore 200 nm track-etch polycarbonate membranes	Whatman/GE Healthcare	110406	used for liposome preparation
PEEK Inline filter holder	Wyatt Technology Europe
Phosphotungstic acid hydrate	Sigma-Aldrich	79690-25G
Polycarbonate bottles for ultracentrifugation	Beckman Coulter	355622
QuantiPro BCA Assay Kit	Sigma-Aldrich	QPBCA-1KT
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Scanning electron microscopy Zeiss EVO HD 15	Carl Zeiss AG
Sepharose Cl-2b	GE Healthcare	17014001
SEM copper grids with carbon film	Plano	S160-4
Small AF4 channel	Wyatt Technology Europe
Sputter-coater Q150R ES	Quorum Technologies
Transmission electron microscopy JEOL JEM 2011	Oxford Instruments
Type 45 Ti ultracentrifugation rotor	Beckman Coulter	339160
Ultimate 3000 Dionex autosampler	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex isocratic pump	Thermo Fisher Scientific
Ultimate 3000 Dionex online vacuum degasser	Thermo Fisher Scientific
Ultracentrifuge OptimaTM L-90 K	Beckman Coulter
UV detector	Thermo Fisher Scientific
Whatman 0.2 µm pore size mixed cellulose filter	Whatman/GE Healthcare	10401712	Used for the filtration of all buffers used with the EVs and in SEC