インビトロおよび創傷治癒の生体内分析のためのスクラッチ移行アッセイとドーサルスキンフォールドチャンバー
Summary
ここでは、一次線維芽細胞を用いてインビトロスクラッチアッセイを行い、マウスにおける生体内皮膚創傷治癒アッセイに関するプロトコルを提示する。両方のアッセイは、インビトロおよびインビボ創傷治癒を評価するための簡単な方法です。
Abstract
生体創傷治癒障害は、糖尿病患者や高齢者にとって大きな関心事であり、効果的な治療が必要である。適切なインビトロおよびインビボアプローチは、皮膚創傷治癒プロセスを改善するために薬物治療のための新しい標的分子の同定に不可欠である。電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したアッセイにおいて創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した、 すなわち、インビトロスクラッチ移行アッセイおよびインビボ背面皮膚折室内モデル。野生型(WT)およびCavβ3欠損マウス(Cavβ3 KO)または線維芽細胞から急性単離された一次マウス胚性線維芽細胞(MEF)またはsiRNAで処理したWTマウスから急性単離した線維芽細胞は、Cacnb3遺伝子の発現をダウンカトリートする、Cavβ3を符号化し、使用した。コンフルエント細胞単層にスクラッチを適用し、ギャップ閉鎖に続いて、移行細胞によるギャップの完全な再集積まで、定義された時点で顕微鏡画像を撮影した。これらの画像を分析し,各条件について細胞移動速度を決定した.インビボアッセイでは、WTおよびCavβ3 KOマウスに背中の皮膚折室内を移植し、直径2mmの定義された円形創傷を適用し、ガラスカバースリップで創傷を覆い、感染症や乾燥から保護し、マクロスコピック創傷閉鎖を監視した。時間が経つにつれて。創傷閉鎖はCacnb3-遺伝子欠損マウスにおいて有意に速かった。インビボとインビトロアッセイの結果は相関性がよくあるため、インビトロアッセイは、インビボ創傷治癒モデルによるインビトロヒットを検証する前のハイスループットスクリーニングに有用でありよい。野生型およびCavβ3欠損マウスまたは細胞についてここで示したものは、Cavβ3以外の特定の分子にも適用可能である可能性があります。
Introduction
皮膚創傷治癒は、皮膚の完全性を回復し、感染から生物を保護するために、皮膚損傷の直後に始まる。創傷治癒プロセスは、4つの重なり合う段階を経る;凝固、炎症、新しい組織形成、および組織リモデリング1.細胞の移行は、これらの段階で非常に重要です。炎症細胞は、免疫細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、および線維芽細胞が異なる時点で活性化され、創傷領域2に侵入する。インビトロおよびインビボで創傷治癒を調査する方法は、根本的なメカニズムを理解するだけでなく、新薬をテストし、皮膚創傷治癒を改善し、加速することを目的とした新しい戦略を開発することに大きな関心を持っています。
セルの移行を監視および分析するには、スクラッチマイグレーションアッセイを使用できます。多くの場合、インビトロ創傷治癒アッセイと呼ばれます。この方法では、細胞培養施設3が必要です。それは簡単なプロシージャであり、ハイエンドの装置の必要性がなく、アッセイはほとんどの細胞生物学の実験室で行うことができる。このアッセイでは、細胞不自由領域は、コンフルエント細胞単層の機械的破壊によって作成され、好ましくは上皮または内皮様細胞または線維芽細胞である。スクラッチの端にあるセルは、作成されたギャップを再設定するために移行します。時間の経過に合った細胞のない領域の定量化は、移動速度に似ており、細胞がギャップを閉じる必要がある時間を示します。この目的のために、研究者は、WTマウスから急性単離された細胞または目的の遺伝子4を欠いているマウス、または信頼性の高い細胞リポジトリから入手可能な不死化細胞のいずれかを使用することができる。スクラッチアッセイは、薬理学的に活性な化合物の影響または細胞移動に対するトランスフェクトされたcDNまたはsiRNAの影響を研究することを可能にする。
生体内では、創傷治癒は複雑な生理学的プロセスであり、皮膚の身体的完全性を可能な限り早く回復させるために、ケラチノサイト、炎症細胞、線維芽細胞、免疫細胞および内皮細胞を含む異なる細胞タイプを必要とする1.生体内創傷治癒における研究の異なる方法は、過去5、6、7、8で開発され、使用されている。この記事に記載されている背中の皮膚折室は、以前に創傷治癒アッセイ9に使用された。マウスに対する修飾後部皮膚折室内製剤として使用される。変更されたスキンフォールドチャンバーモデルにはいくつかの利点がある。1)皮膚収縮を最小限に抑え、創傷治癒過程を観察するのを妨げ、マウスの創傷修復に影響を与える可能性がある。2)この部屋は、ガラスカバースリップで創傷をカバーし、組織感染や乾燥を減らし、治癒プロセスを遅らせる可能性があります。3)血流および血管を直接監視することができる。4)創傷を治療し、治癒を加速するために薬理学的に活性な化合物および試薬の反復的な局所適用を可能にする9、10。
高電圧ゲートカルシウムチャネル(Cavβ3)のβ3サブユニットを、2つの独立したプロトコルを用いて皮膚創傷治癒に影響を与える潜在的な標的分子として同定した。インビトロアッセイでは、一次線維芽細胞を用いて、これらの細胞はCavβ3タンパク質をコードするCacnb3遺伝子を発現するが、脱分極誘発Ca2+流入または電圧依存性Ca2+電流を欠いている。これらの線維芽細胞におけるCavβ3の新規機能を説明した:Cavβ3はイノシトール1,4,5-トリスリン酸受容体(IP3R)に結合し、小平血小石体からのカルシウム放出を制約する。マウスにおけるCacnb3遺伝子の欠失は、IP3に対するIP3Rの感受性の増加、細胞移動の増強および皮膚創傷修復の増加につながる4.
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、インビトロおよびインビボ創傷治癒アッセイについて説明し、得られた結果を相関させる。インビトロアッセイでは、創傷治癒および組織リモデリング11において重要な役割を果たす一次マウス線維芽細胞4、14、15を用いた。単層として増殖する他の付着細胞型(例えば、上皮細胞、内皮細?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、ホムブルクのザールラント大学医学部の臨床実験外科研究所の医学部と動物施設のSPF動物施設(SFB 894のプロジェクトP2)のペトラ・ワイスガーバー博士とトランスジーン・ユニットに感謝します。私たちは、原稿の批判的な読み取りのためにアンドレアス・ベック博士に感謝します。この研究は、ドイツのフォルシュンゲミンシャフト(DFG)ソンダーフォルスチュンスベライヒ(SFB)894、A3からA.B.およびV.F.によって資金提供されました。
Materials
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
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